以及其他細胞類型。感興趣的造血細胞包括任何可能與紅細胞、 淋巴或髓單核細胞譜系有關的有核細胞，以及成肌細胞和成纖維細胞。感興趣的還有干細 胞和祖細胞，如造血、神經(jīng)、基質(zhì)、肌肉、肝、肺、胃腸和間質(zhì)干細胞，例如ES細胞、印i-ES細 胞和誘導的多能干細胞（iPS細胞）。具體的感興趣的細胞包括但不限于：哺乳動物細胞，例 如，HEK-293和HEK-293T細胞、C0S7細胞、Hela細胞、HT1080、3T3細胞等；昆蟲細胞，例如， High5細胞、Sf9細胞、Sf21等。其他感興趣的細胞包括但不限于在美國公開號20120322147 中描述的那些，其中關于細胞的公開內(nèi)容通過引用并入本文。
[0074] 如上所概述的，所述細胞是包含膜結合蛋白、靶蛋白以及在需要時包含微泡誘導 物的細胞，例如，如上文更詳細地描述的。因此，該細胞是已工程構建成包含膜結合蛋白和 靶蛋白的細胞。將細胞工程構建成包含所需蛋白質(zhì)的方案可以根據(jù)一個或多個不同的考慮 如靶細胞的性質(zhì)、分子的性質(zhì)等而不同。該細胞可以包括具有在合適的啟動子控制下的蛋 白質(zhì)編碼序列的表達構建體，其中該啟動子可以是誘導型啟動子或組成活性的。編碼序列 將根據(jù)由其編碼的蛋白質(zhì)的特定性質(zhì)而不同，并且將至少包括編碼二聚化結構域的第一結 構域和編碼膜結合或靶結構域的第二結構域。這兩個結構域可以直接連接或通過連接域彼 此連接。編碼這些融合蛋白的結構域與必需的轉(zhuǎn)錄介導或調(diào)節(jié)元件處于操作組合中，即，是 可操作地連接的?？纱嬖谟诒磉_模塊中的必需的轉(zhuǎn)錄介導元件包括啟動子（包括組織特異 性啟動子）、增強子、終止和聚腺苷酸化信號元件、剪接信號元件等。在一些情況下，感興趣 的是可誘導的表達系統(tǒng)。根據(jù)需要，在細胞中的各種表達構建體可以染色體整合或附加體 維持（maintainedepisomally)。因此，在一些情況下，表達構建體在細胞中染色體整合。 或者，根據(jù)需要，一個或多個表達構建體可以附加體維持。根據(jù)需要/期望地，表達構建體 可在細胞中穩(wěn)定地或瞬時表達。
[0075] 細胞可以使用任何方便的方案制備，其中該方案可以根據(jù)細胞的性質(zhì)、細胞的位 置例如在體外或體內(nèi)等而不同。當需要時，載體，例如質(zhì)?；虿《据d體，可用于工程構建細 胞，以根據(jù)需要表達各種系統(tǒng)組分，例如，膜結合蛋白和靶蛋白、任選的微泡誘導物等。感興 趣的方案包括在公開的PCT申請W01999/041258中描述的那些方案，其中關于方案的公開 內(nèi)容通過引用并入本文。
[0076] 根據(jù)細胞和/或表達構建體的性質(zhì)，感興趣的方案可以包括電穿孔、粒子槍技術、 磷酸鈣沉淀、直接顯微注射、病毒感染等。方法的選擇通常取決于被轉(zhuǎn)化的細胞的類型和轉(zhuǎn) 化發(fā)生時的情況（即，在體外、離體或體內(nèi)）。這些方法的一般討論可見Ausubel等，Short ProtocolsinMolecularBiology, 3rded.，Wiley&Sons, 1995。在一些實施方案中，使用脂 轉(zhuǎn)染胺（lipofectamine)和|丐介導的基因轉(zhuǎn)移技術。在本發(fā)明的核酸已經(jīng)引入細胞中后， 可以通常在37°C下，有時在選擇下，將細胞溫育約1-24小時的時間，以便允許嵌合蛋白的 表達。在哺乳動物靶細胞中，可以使用許多基于病毒的表達系統(tǒng)來表達嵌合蛋白。在使用 腺病毒作為表達載體的情況下，感興趣的嵌合蛋白編碼序列可以連接到腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯 對照復合物，例如，晚期啟動子和三聯(lián)前導序列。然后可通過體外或體內(nèi)重組將這種嵌合基 因插入腺病毒基因組中。插入病毒基因組的非必需區(qū)（例如E1或E3區(qū)）中將產(chǎn)生活的并 能在感染的宿主中表達嵌合蛋白的重組病毒（例如，參見Logan和Shenk,Proc.Natl.Acad. Sci.USA81:355-359(1984))。表達的效率可通過包含合適的轉(zhuǎn)錄增強子元件、轉(zhuǎn)錄終止子 等來增強（參見Bittner等，MethodsinEnzymol. 153:51-544 (1987))〇
[0077] 當期望長期、高產(chǎn)率地產(chǎn)生嵌合蛋白時，可以使用穩(wěn)定的表達方案。例如，可以工 程構建穩(wěn)定地表達嵌合蛋白的細胞系。不是使用含有病毒復制起點的表達載體，而是可以 用嵌合蛋白表達盒和選擇性標記轉(zhuǎn)化宿主細胞。在引入外源DNA后，可以使工程化的細胞 在富集的培養(yǎng)基中生長1-2天，然后轉(zhuǎn)換到選擇性培養(yǎng)基中。重組質(zhì)粒中的選擇性標記賦 予對選擇的抗性，并允許細胞穩(wěn)定地將質(zhì)粒整合到染色體中并生長以形成轉(zhuǎn)化灶，其進而 可以克隆并擴大成細胞系。此外，可以借助于鋅指核酸酶、大范圍核酸酶、TAL效應物核酸 酶或RGEN介導的方法，接著HR或同源重組到人或其他基因組的"安全港"區(qū)域中，來插入 編碼序列。感興趣的安全港區(qū)域包括這樣的區(qū)域：該區(qū)域是單拷貝、二倍體或非整倍體的， 并且不鄰近調(diào)節(jié)生長或者如果未被適當調(diào)節(jié)的話可能會引起癌性轉(zhuǎn)化或其他非治療性干 擾的基因。
[0078] 從產(chǎn)生微泡的細胞生成微泡
[0079] 所述方法的方面包括在足以從細胞產(chǎn)生一個或多個微泡的條件下保持產(chǎn)生微泡 的細胞，例如，如上所述的那些細胞，其中該微泡包括膜結合蛋白和靶蛋白的二聚化復合 物。在本發(fā)明的方法中可以利用在足以產(chǎn)生微泡的條件下保持細胞的任何方便的方法。在 一些情況下，將細胞保持從30分鐘至1周，例如從1小時至3天、1小時至2天，包括1小 時至24小時的一段時間。在一些情況下，將細胞保持從30分鐘至72小時，例如2至72小 時、6至72小時、12至72小時、24至72小時、36至72小時，包括48至72小時的一段時間。 該細胞可在支持從細胞生成微泡的溫度下保持，其中感興趣的溫度包括4至42°C，例如15 至37°C。根據(jù)需要，細胞可以保持在合適的培養(yǎng)基中，其中感興趣的培養(yǎng)基包括但不限于： DMEM、HAMF12、RPMI1640、無血清條件等。
[0080] 根據(jù)細胞的性質(zhì)，該方法的方面可以包括誘導膜結合蛋白、靶蛋白與微泡誘導物 (如果存在）中的一種或多種的表達的步驟。這些蛋白質(zhì)中的一種或多種的表達可由誘導 型啟動子如基于Lac的系統(tǒng)或基于Tet的系統(tǒng)的誘導型啟動子來控制。在這樣的情況下， 該方法可以包括將表達誘導物引入到細胞中，例如，通過使細胞與包含誘導物的培養(yǎng)基接 觸等。
[0081] 在需要時，該方法的方面可包括使細胞與微泡誘導物以足以導致從細胞產(chǎn)生微泡 的方式接觸。例如，在微泡誘導物是小分子誘導物時，該方法可以包括使細胞與包含足夠濃 度的微泡誘導物的培養(yǎng)基接觸。在一些情況下，微泡的產(chǎn)生可以通過以下方式來誘導：改變 細胞的細胞培養(yǎng)條件，例如改變溫度，例如，改變至15至42°C的值，改變Ca2+濃度，例如，如 Biochemistry. 1998 年 11 月 3 ;37 (44) : 15383-91 所述，等等。
[0082] 根據(jù)細胞的性質(zhì)，該方法的方面可以包括將二聚化介體引入細胞中的步驟。可使 用任何方便的方案將二聚化介體引入到細胞中。例如，根據(jù)產(chǎn)生微泡的細胞是在體外還是 在體內(nèi)，所采用的特定方案可以變化。對于體外方案，二聚化介體向細胞中的引入可使用任 何方便的方案來實現(xiàn)。在一些情況下，樣品包括保持在合適的培養(yǎng)基中的細胞，并且將二聚 化介體引入到培養(yǎng)基中。對于體內(nèi)方案，可使用任何方便的施用方案。根據(jù)二聚化介體的 結合親和力，期望的響應，施用的方式，例如靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、口服等，半衰期，存在的 細胞的數(shù)目，可以使用多種方案。
[0083] 在一些實施方案中，該方法還包括從細胞中分離微泡?？梢允褂萌魏畏奖愕姆蛛x 方案。適合的分離方案的實例包括但不限于：過濾、離心、沉淀、基于表面和/或抗體的捕 獲等。在一些情況下，轉(zhuǎn)染后從細胞上清液中收獲微泡。在某些情況下，可以通過根據(jù)本 發(fā)明的細胞的細胞上清液的過濾（例如在〇. 45um孔過濾器上）和超速離心，例如，通過以 110, 000g超速離心1. 5小時或以7500g離心16小時來分離微泡。在某些情況下，可將微泡 冷凍并儲存在_80°C下，而不會失去其將材料轉(zhuǎn)移到靶細胞的能力。在一些實施方案中，微 泡不包括任何編碼感興趣的靶蛋白的核酸。在某些實施方案中，微泡是不含病毒的。
[0084] 可以在本方法期間的任何方便的時間，例如，在細胞保持步驟期間，或在任選的分 離步驟之前或之后，且利用任何方便的方法，來評估微泡中的靶蛋白的量。
[0085] 在某些實施方案中，給定的方法僅采用單個膜結合蛋白/靶蛋白對。在另外其他 的實施方案中，給定的方法可以采用兩個或更多個不同的膜結合蛋白/靶蛋白對，例如當 希望產(chǎn)生其中包裝有兩種或更多種靶蛋白的微泡時。在另外其他的實施方案中，兩種或更 多種不同的靶蛋白可以配置用于二聚化成膜結合蛋白的共同二聚化結構域，使得一個具有 單種膜結合蛋白與兩種或更多種不同的靶蛋白。
[0086] 蛋白質(zhì)富集的微泡
[0087] 本發(fā)明的方面還包括例如通過上述方法產(chǎn)生的蛋白質(zhì)富集的微泡。該微泡可以包 括在脂雙層包膜內(nèi)的例如如上所述的一種或多種膜結合蛋白和一種或多種靶蛋白。因為 微泡是由例如如上所述的產(chǎn)生微泡的細胞所生成的，該微泡的脂雙層組分包括用來生成該 微泡的細胞的膜組分，例如，磷脂、膜蛋白等。另外，該微泡具有胞質(zhì)溶膠，該胞質(zhì)溶膠包括 在用來生成該微泡的細胞中發(fā)現(xiàn)的組分，例如，溶質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸等，但不是細胞的所有組 分，例如，它們沒有細胞核。在一些實施方案中，該微泡被認為是外來體樣的。微泡可以在 大小上不同，并且在一些情況下具有30至300nm，例如30至150nm，并且包括40至100nm 的直徑。
[0088] 在一些情況下，在微泡中，膜結合蛋白和靶蛋白存在于二聚化的復合物中。在一些 情況下，第一和第二二聚化結構域在二聚化的復合物中彼此特異性結合。在其他情況下， 例如，如上所述，第一和第二二聚化結構域通過二聚化介體彼此結合。在一些情況下，該微 泡包含微泡誘導物，例如，病毒膜融合蛋白，如VSV-G。在一些實施方案中，膜結合蛋白的第 一二聚化結構域與微泡的胞質(zhì)溶膠接觸。
[0089] 給定的微泡可以富集單種靶蛋白質(zhì)或兩種或更多種不同的靶蛋白。當兩種或更多 種不同的靶蛋白存在于微泡中時，根據(jù)需要，每種靶蛋白可以與相同的膜結合蛋白二聚化， 或者每種靶蛋白可以與其自身的膜結合蛋白二聚化。這樣，在一些情況下，微泡可以包含具 有共同的膜結合蛋白的二聚化復合物的群體，但在該群體中呈現(xiàn)兩種或更多種不同的靶蛋 白。在其他情況下，該二聚化復合物的群體可包括兩種或更多種不同的靶蛋白，每種與不同 的膜結合蛋白二聚化。因此，該微泡可以進一步包括包含第三二聚化結構域的第二靶蛋白。
[0090] 微泡介導的蛋白質(zhì)向細胞中的遞送
[0091] 如以上所概述的，本發(fā)明的方面包括將蛋白質(zhì)引入到靶細胞中的方法。這樣的方 法包括，例如，如上所述，在足以使微泡與靶細胞融合并將包含在微泡中的靶蛋白遞送到細 胞中的條件下使靶細胞與微泡接觸，其中，該微泡可存在于微泡群體的組成中（例如，其中 微泡的數(shù)目為1〇 3至10 16個，例如10 4至10 13個，包括10 4至109個）?？梢允褂脤⒓毎c微 泡接觸的任何方便的方案。例如，根據(jù)靶細胞是在體外還是在體內(nèi)，所采用的特定方案可以 變化。對于體外方案，可以在足以使微泡與靶細胞融合的條件下，用微泡將靶細胞保持在合 適的培養(yǎng)基中。合適的培養(yǎng)基的實例包括但不限于：DMEM、HamF12、RPMI1640等。靶細胞 和微泡可以保持足以使微泡與細胞融合的一段時間，其中，在一些情況下，該段時間為5分 鐘至72小時，諸如30分鐘至2小時。靶細胞和微泡可以保持在合適的溫度下，例如，范圍 從4°C至42°C，如15°C到37°C的溫度下。對于體內(nèi)方案，可使用任何方便的施用方案。取 決于微泡和靶細胞的向性，期望的響應，施用方式，例如靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、口服等，半衰 期，存在的細胞的數(shù)目，可以使用多種方案。
[0092] 在一些實施方案中，該方法進一步包括破裂（即，解離）在微泡中的二聚化復合 物。該二聚化復合物的解離可以導致細胞中的靶蛋白的更快釋放，從而導致細胞中更快和 或更大的生物應答。該二聚化復合物可以使用任何方便的方案來破裂。在一些實施方案中， 該方法可以包括使微泡與增溶劑即二聚化破壞物化合物接觸，以將微泡中靶蛋白與膜結合 蛋白的復合物解離。可以使用任何方便的增溶劑化合物。感興趣的增溶劑化合物包括但不 限于D/D增溶劑化合物（Clontech,MountainView,CA)。通過以破裂（逆轉(zhuǎn)）其自身締合 的方式與DmrD結構域結合，D/D增溶劑可以解離包括DmrD二聚化結構域的二聚體復合物。 D/D增溶劑還解離包括DmrB同型二聚化結構域的復合物。
[0093] D/D增溶劑的結構
[0094]
[0095] 在其中二聚化復合物包括二聚化介體的那些情況下，例如，如上所述，可以將過量 的介體引入到微泡中，以解離該復合物。當二聚化介體是可修飾的二聚化介體時，該復合物 的解離可包括對微泡施加刺激以修飾可修飾的二聚化介體，從而解離靶蛋白和膜結合蛋白 的二聚體復合物。在這樣的實施方案中，靶細胞可以在向細胞施加刺激如光子、化學劑或酶 之前保持任何方便的時間。這樣，該方法的實施方案的其他方面包括對包含靶細胞和微泡 的樣品施加刺激，以分別修飾可修飾的二聚化結構域和破裂膜結合蛋白和靶