一種抗乳腺癌轉(zhuǎn)移作用的手性紫羅蘭酮生物堿衍生物及醫(yī)藥用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種手性紫羅蘭酬生物堿衍生物、制備方法及其作為抗乳腺癌轉(zhuǎn)移藥 物的應(yīng)用，屬于藥物化學(xué)研究領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，腫瘤發(fā)病率越來越高，已成為危害人們身體健康的頭號(hào)殺手。而腫瘤轉(zhuǎn)移 是腫瘤治療的主要障礙，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，在確診的臨床腫瘤患者中，大約60%的患者已經(jīng)出 現(xiàn)轉(zhuǎn)移。腫瘤已成為當(dāng)今嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病之一。隨著生命科學(xué)的進(jìn)步和醫(yī)學(xué) 的發(fā)展，人類對(duì)腫瘤的認(rèn)識(shí)已經(jīng)深入到分子細(xì)胞層面，各種新的手術(shù)治療手段和化療藥物 不斷問世。然而，據(jù)美國(guó)癌癥研究所統(tǒng)計(jì)，50余年來，癌癥治療并沒有得到根本改觀，癌癥 死亡率仍然居高不下，主要原因是腫瘤轉(zhuǎn)移，沒有腫瘤轉(zhuǎn)移的有效治療手段和藥物。目前世 界公認(rèn)轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤患者死亡的主要原因，大約90%的惡性腫瘤患者死于腫瘤轉(zhuǎn)移。因 此，控制轉(zhuǎn)移是決定腫瘤患者預(yù)后的關(guān)鍵因素。
[0003] 化學(xué)藥物治療，是原發(fā)腫瘤治療及手術(shù)后預(yù)防轉(zhuǎn)移的重要治療手段。幾十年的臨 床實(shí)踐表明，化療藥物多藥耐藥性的發(fā)生W及化療藥物非常嚴(yán)重的毒副作用，不僅嚴(yán)重削 弱了化療效果，而且化療藥物嚴(yán)重?fù)p害患者的免疫系統(tǒng)，基本上破壞了抵抗腫瘤細(xì)胞侵襲 遷移的第一道屏障，半年內(nèi)的腫瘤復(fù)發(fā)率高達(dá)69%，運(yùn)是化學(xué)治療的兩難選擇。迄今為止， 世界上尚沒有抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物問世。
[0004] 腫瘤轉(zhuǎn)移是由腫瘤原發(fā)部位直接向周圍組織擴(kuò)張和擴(kuò)散，或者通過血道或淋己道 轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞在遠(yuǎn)端組織落戶發(fā)展形成新生腫瘤的過程。各種來源的腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn) 移在多數(shù)情況下具有其固定的祀器官，即運(yùn)些具有轉(zhuǎn)移性的腫瘤亞細(xì)胞群在控制得很好的 實(shí)驗(yàn)條件下會(huì)按照一定的過程在特定區(qū)域內(nèi)形成腫瘤轉(zhuǎn)移灶。雖然在不同的腫瘤形成過程 中，腫瘤細(xì)胞的基因會(huì)發(fā)生不同的變化，但是在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程大致相同。2001年，Zlotn化 A小組研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的趨化運(yùn)動(dòng)在腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散中起著關(guān)鍵的作用。趨化因子 CX化12可W誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生趨化運(yùn)動(dòng)。如果使用抑制趨化因子CX化12的受體CXCR4 活性的抗體則可W減弱乳腺癌細(xì)胞的趨化能力，并抑制其擴(kuò)散，抑制腫瘤細(xì)胞的趨化運(yùn)動(dòng) 將能有效地抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散。
[0005] 因此，在干擾或阻斷惡性腫瘤在宿主體內(nèi)播散的過程中，抑制腫瘤細(xì)胞的趨化運(yùn) 動(dòng)是抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物研究中最重要的環(huán)節(jié)，是延長(zhǎng)生存期、提高生存質(zhì)量和降低死亡率的 最有效手段。另一方面，由于常規(guī)原發(fā)腫瘤切除后的抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物治療是持續(xù)的、長(zhǎng)期給 藥過程，理想的抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物不僅阻斷腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的侵襲轉(zhuǎn)移，而且應(yīng)該是非細(xì)胞 毒藥物或者毒副作用很低，不會(huì)對(duì)免疫系統(tǒng)造成損害。鑒于目前抗腫瘤轉(zhuǎn)移化療藥物療效 的局限性及其毒副作用。從中藥中尋找安全性高、且能夠有效預(yù)防和控制腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物 越來越受到重視。
[0006] 本研究組發(fā)明專利公開了一種抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用的轉(zhuǎn)筋草生物堿類化合物（專 利號(hào)：201010114809. 9)，在該發(fā)明基礎(chǔ)上本研究組W活性成分9-(N，N-dimeth}d) -4， 7-megastigmedien-3-〇ne為先導(dǎo)，合成了一系列手性紫羅蘭酬生物堿衍生物，并進(jìn)行了抗 乳腺癌轉(zhuǎn)移活性研究，其中大部分化合物顯示了較強(qiáng)的抗乳腺癌轉(zhuǎn)移活性，化合物18-21a， 12b，13b和1化尤為突出。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種具有抗乳腺癌轉(zhuǎn)移作用的手性紫羅蘭酬生物堿衍生 物W及所述化合物在用于制備抗乳腺癌轉(zhuǎn)移藥物中的用途。
[0008] 本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案加W實(shí)現(xiàn)的：
[0009] -方面，本發(fā)明提供了一種手性紫羅蘭酬生物堿衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽， 其結(jié)構(gòu)如式1和式2所示：
[0010]
[0011] 其中，R選自氨，面素，氯基，徑基，節(jié)氧基，不同取代位置的氣苯，苯基或取代苯基， 芳香雜環(huán)或取代芳香雜環(huán)，贓晚基，化咯基，C1-C8的直鏈或支鏈面代烷基，6位手性中屯、R 或S型，7,8位為雙鍵或飽和；
[0012] R選自氨、徑基、或者不同取代位置的氣苯；
[0013] 所述藥學(xué)上可接受的鹽是指與無機(jī)酸或有機(jī)酸形成的鹽，其中無機(jī)酸或有機(jī)酸選 自鹽酸、氨漠酸、硫酸、憐酸、甲橫酸、苯甲橫酸、草酸、酒石酸、馬來酸、巧樣酸或者抗壞血 酸。
[0014] 本發(fā)明提供的一種手性紫羅蘭酬生物堿衍生物及其藥學(xué)上可接受的鹽的制備方 法，其主要步驟為：W外消旋a -紫羅蘭酬為原料經(jīng)面仿反應(yīng)制備化合物Ia和化的外消旋 體混合物，該混合物經(jīng)手性拆分分別得到光學(xué)純化合物Ia和化，隨后通過酷胺化反應(yīng)，酷 胺還原反應(yīng)，締丙位氧化反應(yīng)，還原胺化或親核取代反應(yīng)制得目標(biāo)化合物。
[0015] 本發(fā)明的具體合成路線如式3所示：
[0016]
[0017] 合成路線試劑和反應(yīng)條件；(a)NaOCl，Et0H，0°C tort;似㈱-(+)-1-Phenylethylamine or(S)-(-)-1-Phenylethylamine，EtOAc，re円旭to 4°C ;(c)EDCl，HOBt，陽(yáng)BA,CH3NH2? HCl，CH2CI2, rt; (cDLiAlHi，THF，40°C ;(e)BoC2〇, NaHO〇3,！HF, rt ;(f)Cr〇3,3,5-dimeth}dprazole，CH2CI2, -20°C ; (g)TFA，CHzClziCTC to ;rt ;(h)parafo;rmaldehyde，NaBHjCN, CHzClziACTC ;(i) substituted fluorobenzyl bromide，K2CO3，DMF，rt ; (j)substituted fluorobenzyl bromide，K2CO3， CH3CN, rt.
[0018] 式3手性紫羅蘭酬生物堿衍生物的合成路線
[0019] 另一方面，本發(fā)明提供了一種手性紫羅蘭酬生物堿衍生物及其藥學(xué)上可接受的鹽 在制備抗乳腺癌轉(zhuǎn)移藥物方面的用途。
[0020] 首先，本發(fā)明對(duì)合成的手性紫羅蘭酬生物堿衍生物進(jìn)行了細(xì)胞毒性的測(cè)定，進(jìn)一 步W非細(xì)胞毒劑量進(jìn)行了抗乳腺癌轉(zhuǎn)移活性篩選，所篩選的衍生物化學(xué)結(jié)構(gòu)如式3所示：
[0021] 各衍生物對(duì)乳腺癌細(xì)胞的毒性作用
[002引 MTT比色測(cè)定法的原理：此分析方法W還原3-(4,5-二甲基嚷挫-2-基）-2,5-二 苯基四挫漠化物（MTT)為基礎(chǔ)，是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)狀況的常用方法。MTT為一種 通用的細(xì)胞染色劑，活細(xì)胞的線粒體中存在與NADP相關(guān)的班巧酸脫氨酶，可將外源性黃色 MlT還原為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物甲臘（Formazane)，并沉積在細(xì)胞中，死細(xì)胞此酶消失， MlT不被還原。用DMSO溶解化rmazane后用酶標(biāo)儀在550nm波長(zhǎng)處檢測(cè)光密度的變化大 小，來衡量測(cè)試藥物對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，進(jìn)而評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性。
[002引實(shí)驗(yàn)步驟：將培養(yǎng)好的細(xì)胞用0. 25%的膜酶消化，吸出膜酶后，用含10% FBS的 培養(yǎng)液終止消化，混勻細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)調(diào)節(jié)密度為IxlO4,將調(diào)好的細(xì)胞懸液加于96孔板，每 孔ISOul，置于37°C，5% %的解箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)，24小時(shí)后加藥，每個(gè)濃度5個(gè)復(fù)孔，加 好藥后繼續(xù)置于37°C，5% C02的解箱內(nèi)培養(yǎng)48小時(shí)，之后每孔加5mg/ml的MTT20U1，繼續(xù) 置于37°C，5% %的解箱內(nèi)培養(yǎng)4小時(shí)，4小時(shí)后取出96板，將上清吸出，每孔加IOOul的 DMS0,用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度。抑制率=(1-加藥組OD值/空白組OD值）x 100%
[0024]抗乳腺癌轉(zhuǎn)移活性評(píng)價(jià)Transwell chemotaxis方法原理：
[00巧]在Transwell小室上腔直接將8 ym孔徑濾膜安放在侵襲腔室的上下腔室之間，月中 瘤細(xì)胞通過變形運(yùn)動(dòng)穿過濾膜，用運(yùn)種模型能夠分析細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的大小。在藥物篩選時(shí) 加入趨化誘導(dǎo)劑（趨化因子EGF)，通過衡量與測(cè)試藥物共培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞和空白組腫瘤細(xì) 胞趨化穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)量變化，來表達(dá)測(cè)試藥物抑制腫瘤細(xì)胞的趨化遷移能力的大小， 進(jìn)而評(píng)價(jià)測(cè)試藥物抗腫瘤轉(zhuǎn)移的活性強(qiáng)弱。陽(yáng)性對(duì)照為試劑LY294002 ( -種具有抗腫瘤轉(zhuǎn) 移作用的PI3K抑制劑）。
[002引實(shí)驗(yàn)步驟：
[0027] 1.樣品非細(xì)胞毒劑量的篩選：利用MT法篩選出非細(xì)胞毒作用的樣品濃度。
[0028]2.樣品與細(xì)胞共培養(yǎng)：將細(xì)胞鋪于6孔板，置于37°C，5% C〇2的解箱內(nèi)培養(yǎng)24小 時(shí)使其貼壁，24小時(shí)后W確定的濃度將樣品加于6孔板內(nèi)，37°C 5% C〇2解箱內(nèi)共解育24小 時(shí)。
[002引 3.趨化實(shí)驗(yàn)：將用樣品處理過的細(xì)胞分別用0. 25%的膜酶消化后，用含10% FBS 的培養(yǎng)液終止消化，該細(xì)胞懸液1300巧m離屯、5分鐘。將上清倒出，加0. 1 %的BM將細(xì)胞 混勻后再次離屯、5分鐘后，計(jì)數(shù)，將細(xì)胞密度調(diào)成5xl05,放置在解箱內(nèi)備用。于冰上配置趨 化因子EGF，加于趨化小室的下室，每孔30ul，將包被好的膜鋪于下室上，放好膠墊，固定上 室，將之前準(zhǔn)備好的細(xì)胞懸液加到上室，每孔50ul，每個(gè)樣品濃度3個(gè)復(fù)孔，加好后置于0)2 解箱內(nèi)培養(yǎng)3.化后取出，取出下室，刮去沒有趨化過來的細(xì)胞，然后用=步染色試劑進(jìn)行 固定和染色，染色后將膜用石蠟油固定，于顯微鏡下計(jì)數(shù)。
[0030] 4.統(tǒng)計(jì)計(jì)算方法：計(jì)數(shù)時(shí)，每個(gè)孔選取5個(gè)視野分別計(jì)數(shù)，取平均值，立個(gè)復(fù)孔再 取平均即為該樣品濃度下的趨化細(xì)胞數(shù)。數(shù)據(jù)用SPSS11. 5進(jìn)行處理，計(jì)算半數(shù)抑制率ICs。。
[0031] 計(jì)算公式：
[0034]實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0035] 優(yōu)選化合物對(duì)MB-MDA-231細(xì)胞（人乳腺癌細(xì)胞）趨化抑制的半數(shù)有效濃度如表 1所示：
[0036] 表1優(yōu)選化合物對(duì)MB-MDA-231細(xì)胞趨化抑制的半數(shù)有效濃度
[0038] 抗乳腺癌轉(zhuǎn)移活性評(píng)價(jià)表明，優(yōu)選化合物均在非細(xì)胞毒劑量下顯示出抗乳腺癌轉(zhuǎn) 移活性，其中化合物18-21a，^b，13b和1化尤為突出。
【附圖說明】
[0039] 圖1 :化合物1化和19a對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白intergrin M和PKCC憐酸化水 平的影響A.化合物1化對(duì)intergrinP 1和PKC C憐酸化水平的影響；B.化合物1化對(duì) intergrin 0 1和PKC C憐酸化水平的量化分析；C.化合物19a對(duì)intergrin 0 1和PKC C 憐酸化水平的影響；D.化合物19a對(duì)intergrinP 1和PKCC憐酸化水平的量化分析
【具體實(shí)施方式】
[0040] 實(shí)施例1.
[0041] 化合物Ia和化的合成方法
[0042] 消旋體化合物1的合成
[0043] 量取20血的a -紫羅蘭酬于反應(yīng)瓶中，加入160血無水乙醇，在30min內(nèi)于冰浴 下滴加次氯酸鋼水溶液500mL。冰浴下攬拌0.化后，再室溫?cái)埌?2h。TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全 (PE : EA=IO : 1)。向反應(yīng)液中加入IN稀鹽酸調(diào)節(jié)反應(yīng)液抑值為酸性，二氯甲燒萃取反 應(yīng)液，萃取=次。收集有機(jī)相，有機(jī)相用無水硫酸儀干燥，過濾，濃縮后得粗品。粗品經(jīng)硅膠 柱層析純化（PE : EA = 10 : 1+0. 3% HAc, V/V)得化合物淡黃色油狀物，產(chǎn)率為95. 1%。
[0044] 化合物Ia的手性拆分
[0045]
[0046] 稱取化合物1 (消旋體，47. 30g，243. 47mmol)于反應(yīng)瓶中，加入254mL重蒸乙酸乙 醋，50°C加熱使其溶解后，加入（時(shí)-(+)-1-苯乙胺（29. 51g，243. 47mmol)，加熱回流IOmin 后，待體系穩(wěn)定至室溫后，將反應(yīng)瓶轉(zhuǎn)至4°C冰箱，慢慢析出大量白色絮狀固體，3化后收 集。把收集后的白色絮狀固體依次用重蒸乙酸乙醋W 5. 5%濃度重結(jié)晶S次。將最后析出 后結(jié)晶溶于二氯甲燒中，室溫?cái)埌?min后，加入IN稀鹽酸調(diào)節(jié)至PH 1~2,室溫?cái)埌?min 后，分離有機(jī)相，將水相用適量的二氯甲燒萃取=次，合并有機(jī)相并用無水硫酸儀干燥，過 濾，減壓蒸饋得到黃色油狀物，產(chǎn)率為32. 1%。[a投巧62.5 (C 1.042, e化anol)，文獻(xiàn)報(bào)道 [a技 +367 (C 1.002，e化anol)腳，ee92. 7% .古 NMR(400MHz，CDCl3):56. 92(dd，J = 15. 4Hz， 9. 9Hz，lH，7-H)，5. 81(d，J = 15. 4Hz，lH，8-H)，5. 50(br s，lH，4-H)，2. 31(d，J = 9. 9Hz， 1H，6-H)，2. 04(br s，2H，3-H)，1.57(d，J = 1.5Hz，3H，13-H)，1.47(m，lH，2-H)，1.20(m， ，0. 93(s，3H，11-H)，0. 86(s，3H，12-H). "c 醒 RdOOMHz，CDCI3) : 5 172. 2 巧-C)， 152. 9 (7-C)，131.6巧-C)，122.8巧-C)，121. 7 (4-C)，54. I (6-C)，32. 5 (I-C)，31. I (2-C)， 27. 7 (Il-C), 26. 7 (12-C), 23. 0 (3-0 , 22. 7 (13-C). ESI-MS m/z 217. I [M+Na]
[0047] 化合物化的手性拆分
[0048]
[0049] 參照化合物la的拆分方法，W (S)-(-)-1-苯乙胺作為拆分溶劑，得到黃色油 狀物，產(chǎn)率為 34.2%。[a]D -363.7(cl.081，e化anol)，ee 92.9%.? NMR(400MHz，CDCls): 5 6.92(dd，J = 15.2Hz，9.細(xì)z，lH，7-H)，5.81(d，J=15.2Hz，lH，8-H)，5.50(brs，lH， 4-H)，2. 31(d，J = 9.細(xì)z，lH，6-田，2. 04 化r s，2H，3-H)，l. 57(s，3H，13-田，1.47(m，lH， 2-H)，I. 21 (m，，0. 93(s，3H，11-H)，0. 86(s，3H，12-H). 1化醒RdOOMHz，CDCI3): 5 171. 4 巧-C)，152. 9 (7-C)，131.6巧-C)，122.8巧-C)，121. 5 (4-C)，54. I (6-C)，32. 5 (I-C)， 31. 1(2-0,27. 7(11-0,26. 8(1