00rpm x 30min)。獲得的包涵體用8M尿素溶解，加入20mM 二硫蘇糖醇。
[0052]采用輕基磷灰石介質(zhì)(如CHT? Ceramic Hydroxyapatite)對由上述方法獲得的變性蛋白進行層析純化。參考B1-Rad公司《CHT? Ceramic Hydroxyapatite Instruct1nManual》第13頁方法，調(diào)節(jié)層析pH為8.0，依次用含有IM NaClUOmM NaH2PO4^50mM NaH2PO4和500mM NaH2PO4的層析液進行鹽濃度洗脫，得到純度大于90%的甘精胰島素融合蛋白變性蛋白。純化樣品經(jīng)電泳分析，組分3純度95%，組分4純度98%，總收率大于90% (圖
2) ο
[0053]實施例3:甘精胰島素融合蛋白復性
[0054]將按照實施例2方法獲得的甘精胰島素融合蛋白變性蛋白溶液稀釋到復性緩沖液中獲得甘精胰島素融合蛋白復性蛋白，復性緩沖液含有20mM NaH2PO4,20mM NaAc、5mMGSH、lmM GSSG，pH值為5.0。在目的蛋白為lOmg/ml的濃度下，復性率為91 %。將獲得的甘精胰島素融合蛋白復性蛋白溶液濃縮并進行緩沖液置換，置換緩沖液含有20mM NaH2PO4,20mM Tris，pH 8.0。RP-HPLC法檢測復性率結果見圖3。
[0055]實施例4:甘精胰島素融合蛋白復性后純化
[0056]將按照實施例3方法獲得的復性蛋白用輕基磷灰石介質(zhì)(如CHT? Cerami cHydroxyapatite)進行層析純化。參考 B1-Rad 公司《CHT? Ceramic HydroxyapatiteInstruct1n Manual》第13頁方法進行，調(diào)節(jié)層析pH為8.0，依次用含有500mM NaCl、5mMNaH2PO4,20mM NaH2POjP 200mM NaH 2P04的層析液進行鹽濃度洗脫，得到純度大于98%的甘精胰島素融合蛋白復性蛋白。純化樣品純度分析見圖4。
[0057]實施例5:甘精胰島素融合蛋白酶切處理
[0058]將按照實施例4方法純化得到的甘精胰島素融合蛋白用蛋白內(nèi)肽酶Kex-2p(EC3.4.21.61)進行連接肽和前肽的切除。按照Kex-2p酶與甘精胰島素融合蛋白摩爾濃度比1:3000加入Kex-2p酶，4°C反應48小時，加5mM EDTA終止酶切。經(jīng)RF-HPLC檢測，酶切效率達到98%，且未檢測到錯切產(chǎn)物(圖5)。
[0059]實施例6:甘精胰島素純化
[0060]將按照實施例5方法制備的酶切產(chǎn)物調(diào)節(jié)pH值至2.5?4.0，使用C8反相柱進行純化。Buffer A 含有 0.2M Na2SO4, 50mM H3PO4, pH 2.5, Buffer B 包含 50 % ACN、0.2MNa2SO4, 50mM H3PO4, pH 2.5，通過線性梯度洗脫得到純度大于99.5%的甘精胰島素蛋白。得到的甘精胰島素蛋白透析至30mM HAc溶液中去除有機溶劑，并進一步制劑得到甘精胰島素產(chǎn)品。RP-HPLC法分析甘精胰島素純度達到99.7 %，結果見圖6。
【主權項】
1.對重組表達的甘精胰島素前體進行純化的方法，其中包括采用羥基磷灰石介質(zhì)對所述甘精胰島素前體進行層析的步驟。2.權利要求1的方法，其中所述方法包括如下步驟: 對原核表達的甘精胰島素前體包涵體采用羥基磷灰石介質(zhì)進行層析； 對獲得的甘精胰島素前體包涵體進行復性；以及 對復性的甘精胰島素前體采用羥基磷灰石介質(zhì)進行層析。3.權利要求2的方法，其中所述對甘精胰島素前體包涵體采用羥基磷灰石介質(zhì)進行層析步驟的條件為: 層析pH 6.5?11，以及 依次用含有 1M NaClUOmM NaH2P04、50mM NaH2P0jP 500mM NaH 2P04的層析液進行鹽濃度洗脫。4.權利要求1-3任一項的方法，其中所述方法包括如下步驟: 在大腸桿菌表達體系中原核表達甘精胰島素前體，獲得甘精胰島素前體包涵體； 對所述甘精胰島素前體包涵體采用羥基磷灰石介質(zhì)進行層析，層析條件為:層析pH8.0，依次用含有 1M NaClUOmM NaH2P04、50mM NaH2P04^P 500mM NaH 2P04的層析液進行鹽濃度洗脫； 對所獲得的甘精胰島素前體包涵體進行復性； 對復性的甘精胰島素前體采用羥基磷灰石介質(zhì)進行層析，層析條件為:層析PH8.0，依次用含有500mM NaCl、5mM NaH2P04、20mM NaH2P04^P 200mM NaH丨04的層析液進行鹽濃度洗脫；以及 獲得純化的甘精胰島素前體。5.權利要求1-4任一項的方法，其中所述甘精胰島素前體的氨基酸序列如圖7所示。6.制備有活性的甘精膜島素的方法，其中包括米用Kex_2p酶對重組表達的甘精膜島素前體進行酶切的步驟。7.權利要求6的方法，其中所述Kex-2p酶的酶切條件為: Kex-2p酶與甘精胰島素前體摩爾濃度比為1:1000?10000，0?37°C反應0.5?60小時。8.權利要求6的方法，其中所述Kex-2p酶的酶切條件為: Kex-2p酶與甘精胰島素前體摩爾濃度比為1:3000，4°C反應48小時。9.制備有活性的甘精胰島素的方法，其中包括如下步驟: 獲得重組表達的甘精胰島素前體； 采用Kex-2p酶對所述甘精胰島素前體進行酶切；和 對酶切產(chǎn)物進行一步層析純化，以獲得有活性的甘精胰島素。10.權利要求9的方法，其中所述一步層析純化采用C8反相柱。11.權利要求10的方法，其中所述C8反相柱層析的條件為:BufferA含有0.2MNa2S04, 50mM H3P04, pH 2.5-4，Buffer B 含有 50 % ACN、0.2M Na2S04, 50mM H3P04, pH2.5-4.0，線性梯度洗脫。12.制備有活性的甘精胰島素的方法，其中包括如下步驟: 在大腸桿菌表達體系中原核表達甘精胰島素前體，獲得甘精胰島素前體包涵體； 對所述甘精胰島素前體包涵體采用羥基磷灰石介質(zhì)進行層析； 對所獲得的甘精胰島素前體包涵體進行復性； 對復性的甘精胰島素前體采用羥基磷灰石介質(zhì)進行層析，獲得純化的甘精胰島素前體； 采用Kex-2p酶對所述甘精胰島素前體進行酶切；和 對酶切產(chǎn)物進行一步層析純化，以獲得有活性的甘精胰島素。13.權利要求12的方法，其中所述一步層析純化采用C8反相柱。14.權利要求13的方法，其中所述C8反相柱層析的條件為:BufferA含有0.2MNa2S04, 50mM H3P04, pH 2.5-4，Buffer B 含有 50 % ACN、0.2M Na2S04, 50mM H3P04, pH2.5-4.0，線性梯度洗脫。15.權利要求12-14任一項的方法，其中所述對甘精胰島素前體包涵體采用羥基磷灰石介質(zhì)進行層析步驟的條件為: 層析pH 6.5?11，以及 依次用含有 1M NaClUOmM NaH2P04、50mM NaH2P0jP 500mM NaH 2P04的層析液進行鹽濃度洗脫。16.權利要求12-15任一項的方法，其中所述Kex-2p酶的酶切條件為: Kex-2p酶與甘精胰島素前體摩爾濃度比為1:1000?10000，0?37°C反應0.5?60小時。17.權利要求16的方法，其中所述Kex-2p酶的酶切條件為: Kex-2p酶與甘精胰島素前體摩爾濃度比為1:3000，4°C反應48小時。18.羥基磷灰石介質(zhì)在層析純化甘精胰島素前體包涵體蛋白中的用途。19.羥基磷灰石介質(zhì)在層析純化甘精胰島素前體復性蛋白中的用途。20.Kex_2p酶在酶切轉(zhuǎn)化甘精膜島素前體以獲得有活性的甘精膜島素中的用途。
【專利摘要】本發(fā)明提供了對重組表達的甘精胰島素前體進行純化的方法，其中包括采用羥基磷灰石介質(zhì)對所述甘精胰島素前體進行層析的步驟。本發(fā)明還提供了制備有活性的甘精胰島素的方法，其中包括采用Kex-2p酶對重組表達的甘精胰島素前體進行酶切的步驟。在本發(fā)明一個優(yōu)選實施方案中，所述方法包括：獲得重組表達的甘精胰島素前體；采用Kex-2p酶對所述甘精胰島素前體進行酶切；對酶切產(chǎn)物進行一步層析純化，以獲得有活性的甘精胰島素。
【IPC分類】C12P21/06, C07K14/62, C07K1/22
【公開號】CN105294854
【申請?zhí)枴緾N201510219297
【發(fā)明人】常國棟, 周代福, 竇鑫, 劉鵬
【申請人】北京普羅吉生物科技發(fā)展有限公司, 清華大學
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2015年5月4日