一種利于細(xì)胞粘附的功能絲素膜的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的絲素材料的制備方法，具體設(shè)及一種利于 細(xì)胞粘附的功能絲素膜的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] RGD序列由精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸組成，廣泛存在于多種細(xì)胞外基質(zhì)中，膠原 蛋白、纖粘連蛋白、層粘連蛋白、玻璃粘連蛋白、彈性蛋白等等細(xì)胞外基質(zhì)，可與多種整合素 特異性結(jié)合，有助于細(xì)胞粘附，促使貼壁細(xì)胞粘附生長。經(jīng)RGD化學(xué)修飾的絲素膜及其他 改性材料如高分子聚合物等能提高細(xì)胞在材料上的粘附、擴(kuò)散和增殖（如JBiomedMater ResA，2003,67 (2)，559-570 ;Biomaterials，2002, 23 :4315-4323 等）。RGD膚還能夠競爭 性抑制如纖維蛋白等的各種粘附蛋白與血小板的結(jié)合，及血小板在材料上的粘附化etters inP巧tideScience, 2002,9 :101-109),從而阻止血栓的形成。
[0003] 現(xiàn)有銷售的RGD膚都是來自于化學(xué)合成的膚，包括鏈?zhǔn)侥w和環(huán)狀膚。隨著基因工 程技術(shù)的迅猛發(fā)展，重組表達(dá)已成為功能膚制備的一種重要技術(shù)。有研究指出一種重組的 含RGD的絲蛋白具有良好的細(xì)胞粘附與增殖能力（化學(xué)學(xué)報，2006,64 :1273-1278)。有報 導(dǎo)稱骨細(xì)胞在重組表達(dá)的含RGD的寡膚上的粘附性和分化能力優(yōu)于賴氨酸包被的培養(yǎng)板 度iotechnolLett, 2007,29 :359-363)。又如研究指出重組RGD蜘蛛絲蛋白能支持未分化 的小鼠成骨細(xì)胞的分化度iomaterials，2008, 29 :2556-2563);將RGD重組蜘蛛絲和聚乙締 醇高分子材料結(jié)合起來，能支持鼠胚胎成纖維細(xì)胞的生長（中國修復(fù)重建外科雜志，2009， 23 :747-750)等等。
[0004] 蠶絲是一種良好的天然生物材料，國內(nèi)外研究的主要W家蠶絲素為主，而關(guān)于野 蠶絲如昨蠶絲或天蠶絲用于生物材料的研究報導(dǎo)很少（JournalofWuhan化iversity ofTechnology!MaterialsScinece,2011,26(6) :1044-1048；BiomedMater,2006,1 ： 181-187)，由于不能家養(yǎng)，產(chǎn)量很低。但值得注意的是，昨蠶絲素或天蠶絲素的氨基酸序列 中分布有大量的含RGD=膚的單元重復(fù)片段，運種來自于天然野蠶絲素中的含RGD的單元 序列及重復(fù)序列的功能還沒有研究報導(dǎo)，更沒有應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽0化]基于天然野蠶絲素蛋白（昨蠶絲素或天蠶絲素）含有RGD功能多膚片段但蠶絲產(chǎn) 量極低的現(xiàn)狀，本發(fā)明旨在提供一種來自于生物體合成的功能多膚（-RGD-)4和（-RGD-)S及 其改性的家蠶絲素膜的制備方法，其中-RGD-的氨基酸序列是來自于天然野蠶絲素蛋白中 的一段，制備出的功能絲素膜屬于生物醫(yī)用材料，沒有細(xì)胞毒性，具有細(xì)胞粘附蛋白的識別 位點，有利于細(xì)胞粘附、生長、促進(jìn)缺損組織愈合。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過W下技術(shù)方案實現(xiàn)： 陽007] -種利于細(xì)胞粘附的功能絲素膜的制備方法，包括如下步驟：
[0008] 步驟1)根據(jù)對昨蠶絲素或天蠶絲素氨基酸序列的分析，設(shè)計一個其中含有RGD= 膚序列的單元膚段GSGAGGRGDGGYGDGSS，命名為（-RGD-)i多膚基因；
[0009] 步驟2)采用基因工程技術(shù)對所述（-RGD-)i多膚基因進(jìn)行4倍克隆，并設(shè)計構(gòu)建 攜帶有（-RGD-)4多膚基因的原核系統(tǒng)表達(dá)載體，所述（-RGD-) 4多膚的氨基酸序列如SE化 ID.NO. 1 ;
[0010] 或，采用基因工程技術(shù)對所述（-RGD-)i多膚基因進(jìn)行8倍克隆，并設(shè)計構(gòu)建攜 帶有（-RGD-)S多膚基因的原核系統(tǒng)表達(dá)載體，所述（-RGD-)S多膚的氨基酸序列如SE化 ID.NO. 2 ; W11] 步驟如將已經(jīng)設(shè)計構(gòu)建好的攜帶有（-RGD-)4多膚或（-RGD-)S多膚基因的原核系 統(tǒng)表達(dá)載體度i〇-MedicalMaterialsand!Engineering，2014, 24 :2057-2064)轉(zhuǎn)染大腸桿 菌度L21)細(xì)胞，用Luria-Bertani培養(yǎng)基經(jīng)異丙基-e-D-硫代半乳糖巧誘導(dǎo)培養(yǎng)數(shù)小時；
[0012] 步驟4)離屯、細(xì)胞菌液，收集菌細(xì)胞并破碎菌細(xì)胞，然后將破碎后的蛋白上清液加 入到谷脫甘膚轉(zhuǎn)移酶的親和層析中一步法純化、酶切、收集、凍干，最終獲得（-RGD-)4多膚 粉末或（-RGD-)s多膚粉末，使用時配置一定濃度的水溶液；
[0013] 步驟5)將家蠶蠶絲或蠶雖進(jìn)行脫膠、溶解后，灌注于透析袋內(nèi)，用去離子水透析， 然后過濾濃縮至3~8%的家蠶絲素蛋白溶液，誘注于一定面積的器皿中風(fēng)干，得到家蠶絲 素膜；
[0014] 步驟6)將制得的上述家蠶絲素膜浸潰于過量的交聯(lián)劑溶液中，再加入（-RGD-)4 多膚或（-RGD-)s多膚，4°C過夜反應(yīng)，即得功能絲素膜。
[0015] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有W下有益效果：
[0016] 基于天然野蠶絲素蛋白（昨蠶絲素或天蠶絲素）含有RGD功能多膚片段但蠶絲 產(chǎn)量極低的現(xiàn)狀，本發(fā)明旨在提供一種利于細(xì)胞粘附的功能絲素膜的制備方法。通過該方 法的制備出的功能絲素膜具有優(yōu)異的細(xì)胞粘附性能，屬于生物醫(yī)用材料，沒有細(xì)胞毒性，具 有細(xì)胞粘附蛋白的識別位點，有利于細(xì)胞粘附、生長、促進(jìn)缺損組織愈合。其原因是由于本 發(fā)明提供的多膚是來自于天然野蠶絲素中含RGD的功能序列的一段（-RGD-)i多膚及其重 復(fù)序列，不僅膚鏈側(cè)基含有大量的親水性基團(tuán)，有利于細(xì)胞生長和組織愈合；而且每一分子 的膚鏈含有多個細(xì)胞粘附蛋白的識別位點RGD，同樣接枝一分子的多膚，（-RGD-)4多膚和 (-RGD-)S多膚最多可W分別具有4個和8個RGD位點，可更好地促進(jìn)細(xì)胞的粘附和鋪展。同 時，本發(fā)明提供的多膚來自于生物體表達(dá)，無毒無刺激性，分子量單一，能與家蠶絲素蛋白 共價結(jié)合，穩(wěn)定地賦予家蠶絲素膜更好的細(xì)胞粘附功能。另外，本發(fā)明中含RGD多膚的獲得 (純化、酶切）是在GST親和層析柱中一步完成，減少了對表達(dá)產(chǎn)物的破壞。
[0017]上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段， 并可依照說明書的內(nèi)容予W實施，W下W本發(fā)明的較佳實施例詳細(xì)說明如后。
【具體實施方式】
[001引下面將結(jié)合實施例，來詳細(xì)說明本發(fā)明。
[0019] 一種利于細(xì)胞粘附的功能絲素膜的制備方法，可W通過如下實施例實施。在制備 該功能絲素膜之前，先根據(jù)對昨蠶絲素或天蠶絲素氨基酸序列的分析，設(shè)計一個其中含有RGDS膚序列的單元膚段GSGAGGRGDGGYGDGSS，命名為（-RGD-)1多膚。然后采用基因工程 技術(shù)對所述（-RGD-)i多膚基因進(jìn)行4倍克隆，并設(shè)計構(gòu)建攜帶有（-RGD-)4多膚基因的原核 系統(tǒng)表達(dá)載體，所述（-RGD-)4多膚的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.I;或采用基因工程技術(shù)對 所述（-RGD-)i多膚基因進(jìn)行8倍克隆，并設(shè)計構(gòu)建攜帶有（-RGD-)S多膚基因的原核系統(tǒng)表 達(dá)載體，所述（-RGD-)s多膚的氨基酸序列如SEQ.ID.NO. 2。 I；0020] 實施例一；
[0021] 1、將攜帶有（-RGD-)4多膚基因的原核系統(tǒng)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染大腸桿菌度L21)細(xì)胞， 涂覆于含氨節(jié)青霉素的Luria-Bertani固體培養(yǎng)基，倒置放入37°C的生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)14~ 16小時。挑取單一菌落放入4mL的新鮮含氨節(jié)青霉素的Luria-Bertani液體培養(yǎng)基中，插 入振蕩速度20化/min的空氣搖床37°C振蕩培養(yǎng)8~10小時。將培養(yǎng)的菌液按1:100的比 例于IL新鮮含氨節(jié)青霉素的Luria-Bertani液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增培養(yǎng)。當(dāng)菌液密度達(dá)ODe。。 =0. 3~2. 1時加入0~1.OmM的異丙基-0 -D-硫代半乳糖巧誘導(dǎo)培養(yǎng)1~8小時，4°C 離屯、收集菌細(xì)胞。
[0022] 2、將收集的菌細(xì)胞用谷脫甘膚轉(zhuǎn)移酶（GST)親和層析的結(jié)合緩沖液重懸混勻，置 于冰上超聲波破碎細(xì)胞、釋放蛋白質(zhì)。破碎完成后120(K)r/min、4°C離屯、IOmin收集含有 (-RGD-)4多膚的上清液。表達(dá)的含有（-RGD-) 4多膚序列的蛋白是含有GST標(biāo)簽的融合蛋 白gst-(-rgd-)4。
[0023] 3、含有GST-(-RGD-) 4的上清液灌注GST親和層析柱，洗脫非特異性蛋白。然后按 每毫克融合蛋白加入5~IOu凝血酶20°C放置16小時。最后緩慢流出并收集流出液即獲 得（-RGD-)4多膚溶液。
[0024]4、將（-RGD-)4多膚溶液加入脫鹽柱脫凈溶液中的所有