一種草酸青霉及制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及植物保護(hù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種能括抗油茶主要病害的生防菌株。同時(shí) 還設(shè)及一種草酸青霉化niciliumoxalicumstrainF217-3的制備方法，還設(shè)及一種草酸 青霉化niciliumoxalicumstrainF217-3在制備治療或預(yù)防油茶主要病害藥物中的應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 油茶（Camelliaoleifera)屬山茶科（Theaceae)山茶屬（Camellia)，是我國(guó)南 方特有的一種木本油科樹種，請(qǐng)見（莊瑞林.中國(guó)油茶[M].北京：中國(guó)林業(yè)出版社，2008: 1-2.)。油茶全身都是寶，種子是優(yōu)質(zhì)、高級(jí)食用油的原料；茶油在醫(yī)藥、工業(yè)上應(yīng)用廣泛； 茶枯也是優(yōu)質(zhì)的有機(jī)肥料，提取后的固體殘?jiān)勺鳛樨i的精飼料。因此，油茶具有很好的應(yīng) 用開發(fā)前景，是我國(guó)很重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。
[0003] 隨著我國(guó)南方各地油茶種植面積逐年增加，各類油茶病害也日趨嚴(yán)重。油茶炭 痘病、葉枯病、軟腐病是由病原物引起的3種毀滅性病害，在我國(guó)各油茶產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生， 請(qǐng)見（束慶龍，張良富.中國(guó)油茶栽培與病蟲害防治[M].北京：中國(guó)林業(yè)出版社，2009 : 147-148.)。同樣，油茶其他病害如根腐病、茶餅病、黑斑病等也時(shí)常發(fā)生，每年油茶產(chǎn)業(yè)因 病害造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。尋求安全、高效和經(jīng)濟(jì)的生物源農(nóng)藥是當(dāng)前防治油茶病害的 當(dāng)務(wù)之急，其中括抗微生物在植物病害生物防治中起到十分重要的作用。
[0004] 在植物病害的生物防治中研究和應(yīng)用較多的微生物主要有細(xì)菌類、真菌類和放線 菌。真菌類主要有木霉屬的哈茨木霉、康寧木霉、青霉、絲核菌、酵母菌等。MelgarejoP等 報(bào)道了從桃枝條分離的penicilliumpurpurogenum對(duì)桃褐腐病原菌的防效果（Melgarejo P,CalAD,M.-SagastaE.InfluenceofPenicilliumfrequentansandtwoofits 過(guò)打tibioticsO打productio打ofStrom過(guò)t過(guò)byMo打ili打i過(guò)Isxsi打culture[J].Csosdiso journalofbotany, 1989, 67Q) :83-87.);申光輝等篩選到灰黃青霉巧enicillium griseo化Ivum)和±曲霉（Aspergillusterreus)兩種括抗真菌對(duì)草替根腐病有較強(qiáng)的括 抗作用（申光輝，薛泉宏，張晶，等.草替根腐病括抗真菌篩選鑒定及其防病促生作用[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012 (22) :4612-4626.);王國(guó)平等從南方紅豆杉分離到的一種新內(nèi)生真菌 紫杉木霉Trichodermataxi菌株，該內(nèi)生真菌通過(guò)菌絲纏繞附著等重寄生方式，導(dǎo)致水稻 紋枯病菌菌絲斷裂或其內(nèi)含物降解直至死亡（王國(guó)平，魯書玲，鄭必強(qiáng)，等.內(nèi)生真菌紫杉 木霉ZJUF0986菌株及其活性代謝產(chǎn)物防治水稻紋枯病的效果[J].中國(guó)生物治2009(01); 30-34.);同時(shí)也有生物農(nóng)藥草酸青霉水劑對(duì)玉米小斑病的防治研究（王勇，張文革，何踰， 等.生物農(nóng)藥草酸青霉水劑對(duì)玉米小斑病的防治效果[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007,35(7): 1965-1966.)。然而，關(guān)于青霉菌在油茶主要病害上的防治研究及應(yīng)用報(bào)道很少，且還未見 對(duì)防治油茶黑斑病及油茶潰瘍病兩種病害的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引 本發(fā)明的目的是在于提供了一種草酸青霉化niciliumoxali州mstrain F217-3,該菌株分離自健康油茶根際±壤，對(duì)油茶主要病害均具有高效的括抗作用，是一 株廣譜性生防青霉菌，填補(bǔ)了利用草酸青霉防治多種油茶病原真菌的技術(shù)空白，并具有較 強(qiáng)溶解多種無(wú)機(jī)憐的能力和促進(jìn)作物生長(zhǎng)的作用，對(duì)油茶無(wú)公害防治具有一定的實(shí)際意 義。
[0006] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供了一種草酸青霉化niciliumoxali州mstrain F217-3生防菌劑的制備方法，方法易行，操作簡(jiǎn)便，設(shè)及到的固體培養(yǎng)基是生活中容易獲得 且成本低廉的原料，實(shí)用性強(qiáng)。
[0007] 本發(fā)明的第3個(gè)目的是在于提供了一種草酸青霉化niciliumoxali州mstrain F217-3在制備治療或預(yù)防油茶主要病害藥物中的應(yīng)用，該菌株的生防菌劑可高效防治油茶 炭痘病、葉斑病、黑斑病、潰瘍病等，平板對(duì)時(shí)實(shí)驗(yàn)表明，該草酸青霉化nici1iumoxalicum strainF217-3對(duì)油茶主要病害的抑菌率達(dá)到90%W上。
[000引為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用W下技術(shù)措施：
[0009] 其技術(shù)構(gòu)思是：采用常規(guī)法進(jìn)行分離、純化和保存對(duì)油茶主要病害有括抗作 用的生防菌株。請(qǐng)見（姚麗逵，王埼，付學(xué)池，等.小麥紋枯病生防芽抱桿菌的篩選及 鑒定[J].中國(guó)生物防治，2008,24(1) :53-57.)。W油茶病原真菌為指示菌，分離得到 的菌株為待檢菌，采用平板對(duì)時(shí)法篩選其中能括抗油茶病原菌的括抗菌。平板對(duì)時(shí)法 請(qǐng)見（刷desT,BanhegyiI,HerpaiZ,etal.IsolationofBacillusstrainsfrom therhizosphereofcere曰Isandinvitroscreeningforantagonism曰gainst phytop曰thogenic,food-bornepathogenic曰ndspoilagemicro-org曰nisms[J].Journ曰I ofAppliedMicrobiology, 2000, 89(5):840-846.)然后采用發(fā)酵法進(jìn)行復(fù)篩，將初篩到的 菌株分別在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24-5化后，培養(yǎng)液用0. 22ym微孔過(guò)濾器過(guò)濾得到培養(yǎng)濾 液。分別將培養(yǎng)濾液與約50°C的PDA固體培養(yǎng)基按照1:19混勻后倒入培養(yǎng)皿，冷卻后在 平板中央放入直徑為7mm的油茶主要病原菌菌餅，W無(wú)菌水為對(duì)照，每個(gè)處理=次重復(fù)。5 天后測(cè)量病原菌菌落直徑。篩選出對(duì)油茶主要病害有括抗作用的菌株。最終確定F217-3 對(duì)油茶主要病害的括抗作用最強(qiáng)，篩選得到效果明顯且穩(wěn)定的1株括抗菌F217-3。發(fā)酵法 請(qǐng)見（姚麗逵，王埼，付學(xué)池，等.小麥紋枯病生防芽抱桿菌的篩選及鑒定[J].中國(guó)生物防 治，2008, 24(1) :53-57.)。
[0010] 所述草酸青霉化niciliumoxalicumstrainF217-3固體菌劑按下述方法獲得： 將青霉的保藏菌種置入試管斜面培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，再置入裝有SOmL液體培養(yǎng)基的250mL S角瓶中在搖床上培養(yǎng)36-5化，轉(zhuǎn)速150-18化pm，溫度25-30°C;結(jié)束后W3% -6%接種 量（V/W)接入固體培養(yǎng)基在25-30°C環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)3-5山每隔24-3化翻拌一次，至產(chǎn)抱； 自然風(fēng)干或者30-35°C烘干后粉碎過(guò)10-20目篩，獲得固體菌劑，固體菌劑中的含菌量為 109iicfu/g。在獲得草酸青霉F*eniciliumoxali州mstrainF217-3固體菌劑的過(guò)程中，所 述試管斜面培養(yǎng)基為：稱取馬鈴馨200g，去皮，切成小塊煮沸30min，兩層紗布過(guò)濾后加入 葡萄糖20g，融化后補(bǔ)足水至1000 mU瓊脂15-20g，121°C高壓滅菌20min獲得試管斜面培 養(yǎng)基；液體培養(yǎng)基去掉上述試管斜面培養(yǎng)基中瓊脂成分獲得；所述固體培養(yǎng)基為：麥教、草 炭、殼聚糖，它們的質(zhì)量比為1 :2 :1。
[0011] 一種括抗油茶病害的草酸青霉化niciliumoxalicumstrainF217-3的制備方 法，其步驟是：
[0012] A、括抗真菌的分離純化：取健康油茶根際±樣加入到盛有無(wú)菌水和玻璃珠的=角 瓶中，制成懸浮液，在20-30°C溫度下?lián)u床中振蕩。將±壤懸浮液移入盛有無(wú)菌水的試管中， 制成10 1菌懸液，依次類推，獲得10 2, 10 3, 10 4, 10 5W及10 6菌懸液。梯度稀釋后，涂布在 分離培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基配方如下（IL):稱取馬鈴馨200g，去皮，切成小塊煮沸30min，兩層紗 布過(guò)濾后加入葡萄糖20g，融化后補(bǔ)足水至1000血，瓊脂15-20g，121°C高壓滅菌20min。將 涂布有菌懸液的平板置于培養(yǎng)箱中，觀察分離培養(yǎng)基上菌落狀態(tài)，用=步劃線法進(jìn)行分離 純化，分離到20株菌株統(tǒng)一編號(hào)登記如下：F217-l、F217-2、F217-3…F217-20。菌種保藏： 接種斜面后，可在4°C短暫保藏。用50% (V/V)甘油（上海振興化工一廠）作為保護(hù)劑，可 在-80 °C長(zhǎng)久保藏。
[0013] B、括抗真菌的初篩：采用平板對(duì)時(shí)法篩選其中能括抗油茶病原菌的括抗真菌，將 打好的病原菌餅和括抗菌菌餅放置平板中屯、線上，分別距離平板中屯、1. 5cm，置于恒溫培養(yǎng) 箱培養(yǎng)，觀察抑菌帶有無(wú)及大小，每個(gè)處理重復(fù)3次。進(jìn)一步篩選抑菌直徑大于8mm的菌株。 通過(guò)上述步驟共獲得3株對(duì)油茶主要病害有括抗效果的菌株F217-1、F217-3、F217-15。
[0014] C、括抗真菌的復(fù)篩：將初篩有括抗作用的菌株經(jīng)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，lOOOOr/min 室溫離屯、，用0. 22ym的微孔濾膜過(guò)濾除去菌體，取括抗菌濾液與滅菌后約50°C的PDA固體 培養(yǎng)基按照1:19混勻后倒入培養(yǎng)皿，冷卻后在平板中央放入直徑為7mm的油茶主要病原菌 菌餅，W無(wú)菌水為對(duì)照，每個(gè)處理=次重復(fù)。測(cè)量病原菌菌落直徑。最后獲得括抗效果明顯 且穩(wěn)定的1株括抗菌草酸青霉（PeniciliumoxalicumstrainF217-3)
[0015] 通過(guò)上述步驟獲得了一種草酸青霉化niciliumoxalicumstrainF217-3菌株。 申請(qǐng)人從健康油茶根際±壤篩選得到一株青霉菌，結(jié)合生理生化特征和分子特征鑒定為草 酉《青霉，并命名為PeniciliumoxalicumstrainF217-3。該菌株P(guān)eniciliumoxalicum strainF217-3已于2015年10月20日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中屯、（簡(jiǎn)稱CCTCC，湖 北省武漢市武昌塔挪山），保藏編號(hào)為M2015625。
[0016] 所述的一種草酸青霉F*enicilium oxalicum strainF217-3 菌株中含有SEQID NO:1所示的核巧酸序列。
[0017] 一種草酸青霉F*eniciliumoxalicumstrainF217-3菌株有如下特征：PDA培養(yǎng)基 上菌落圓形，邊緣白色，抱子形成后菌落呈黃綠至深綠色；其顯微圖片顯示，該菌分生抱子 梗直立，無(wú)色，有分隔，分生抱子球形至楠圓形、無(wú)色至著色、光滑