一株枯草芽孢桿菌cyy-25及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一株枯草芽抱桿菌CYY-25及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 紫花首猜（MedicagosativaL.)是目前世界上種植最早、栽培最廣的優(yōu)質(zhì)多年生 豆科牧草，具有產(chǎn)草量高、再生性強、利用年限長、適口性強、營養(yǎng)豐富等優(yōu)點。至今，紫花首 猜在我國的種植歷史已超過兩千年，其亦是我國種植面積最大的牧草。然而紫花首猜的一 種世界性病害，根腐病（Rootrot),會危害紫花首猜的各個生長時期，主要癥狀表現(xiàn)為根部 出現(xiàn)壞死斑，甚至腐爛、死亡，莖葉全部枯死，嚴重影響紫花首猜的品質(zhì)和產(chǎn)量，運種病害還 會隨著種植面積和年限的增長而加重。雖然紫花首猜根腐病病原復(fù)雜，但據(jù)研究表明多與 鑲刀菌有關(guān)。
[0003] 近年來，植物根際促生細菌（Plantgrowth-promotingrhizobacteria，PGPR)的 研究日益受到人們的關(guān)注。芽抱桿菌度acillusspp.)是PGH?重要的組成部分，既可W促 進植物生長，還有生物防治作用。PGra主要通過合成IAA和嗜鐵素，溶解±壤中難溶的憐， 促進植物營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而促進植物生長；PGH?主要產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)為脂膚化合物， 包括豐原素（Fengycin)、伊枯草菌素（I化in)和表面活性素（Surfactin)等，其在防治植物 病害方面起著重要作用。因此，開發(fā)能夠促進植物生長且能夠有效防治植物病害的PGH?是 目前研究工作的重點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一株枯草芽抱桿菌CYY-25及其應(yīng)用。 陽0化]本發(fā)明是通過W下技術(shù)方案來實現(xiàn)：
[0006] 本發(fā)明提供了一株枯草芽抱桿菌CYY-25,該枯草芽抱桿菌CYY-25命名為 Bacillussubtilis,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，保藏號為 CGMCCNo. 8995。
[0007] 該菌能夠合成嗎I噪乙酸、嗜鐵素，還能夠溶解無機憐。本發(fā)明公開了枯草芽抱桿菌 CYY-25作為促進植物生長菌劑的應(yīng)用。所述的菌劑為促嗎I噪乙酸合成的菌劑、促嗜鐵素合 成的菌劑或溶解無機憐的菌劑中的一種或幾種。
[0008] 本發(fā)明還公開了枯草芽抱桿菌CYY-25在制備用于促進植物生長的菌劑中的應(yīng) 用。
[0009] 所述的菌劑為促嗎I噪乙酸合成的菌劑、促嗜鐵素合成的菌劑或溶解無機憐的菌劑 中的一種或幾種。
[0010] 本發(fā)明公開了枯草芽抱桿菌CYY-25作為防治植物病原真菌引起的植物病害的菌 劑的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明公開了枯草芽抱桿菌CYY-25在制備用于防治植物病原真菌引起的植物病 害的菌劑中的應(yīng)用。
[0012] 所述的菌劑為防治首猜根腐病的菌劑。
[0013] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有W下有益的技術(shù)效果：
[0014] 本發(fā)明提供的枯草芽抱桿菌度acillussubtilis)CYY-25于2014年4月3日 保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、（CGMCC)，其保藏編號為CGMCC No.8995。
[0015] 本發(fā)明枯草芽抱桿菌CYY-25可W合成IAA、嗜鐵素，溶解難溶無機憐，能夠促進植 物生長，對尖抱鑲刀菌、稻梨抱菌、核盤菌、串珠鑲刀菌、油菜菌核病菌等多種植物病原真菌 都具有較好的抑制作用，且對首猜根腐病的防治具有重要意義，適于作為農(nóng)業(yè)菌劑加W開 發(fā)利用。
[0016] 保藏說明
[0017] 本發(fā)明對所述的枯草芽抱桿菌CYY-25進行了下述保藏：
[001引保藏時間：2014年4月3日，保藏地點：中國，北京。北京市朝陽區(qū)北辰西路1 號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、 (CGMCC);保藏號為CGMCCNo. 8995。
【附圖說明】
[0019] 圖1為枯草芽抱桿菌CYY-25度acillussubtilis)在PDA培養(yǎng)基上的生長狀況。
[0020] 圖2為枯草芽抱桿菌CYY-25度acillussubtilis)在不同濃度khp存在下IAA 合成量的變化。
[0021] 圖3為枯草芽抱桿菌CYY-25度acillussubtilis)對紫花首猜（農(nóng)牧803)促生 30d時盆栽效果。
[0022] 圖4為枯草芽抱桿菌CYY-25度acillussubtilis)對11種植物病原真菌的抑制 作用，其中：曰：尖抱鑲刀菌；b:稻梨抱菌；C:金黃殼囊抱菌；d:核盤菌；e:串珠鑲刀菌；f: 灰葡萄抱菌；g:禾谷鑲抱菌；h:茄鏈格抱菌；i:立枯絲核菌；j:禾旋抱腔菌；k:油菜菌核 病菌；
[0023] 圖5為枯草芽抱桿菌CYY-25度acillussubtilis)的發(fā)酵液對尖抱鑲刀菌菌絲和 抱子生長的抑制作用（40X);
[0024] 圖6為枯草芽抱桿菌CYY-25度acillussubtilis)對紫花首猜根腐病的防治作 用；
[0025] 其中，對照1是僅破壞紫花首猜植株根部；對照2是破壞紫花首猜植株根部，且用 尖抱鑲刀菌浸根；實驗組是破壞紫花首猜植株根部，用尖抱鑲刀菌浸根，同時用CYY-25菌 懸液灌根； 陽0%] 圖7為枯草芽抱桿菌CYY-25度acillussubtilis)的系統(tǒng)發(fā)育樹圖譜。
【具體實施方式】
[0027] 下面結(jié)合具體的附圖和實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，所述是對本發(fā)明的 解釋而不是限定。
[0028] 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的實 驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。W下實施例中的定量實驗， 均設(shè)置=次W上重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。
[0029] 一、枯草芽抱桿菌CYY-25(Bacillussubtilis)的分離鑒定
[0030] 1、一、枯草芽抱桿菌CYY-25 度acillussubtilis)的分離
[0031] 1) ±樣采集
[0032] 供試±樣取于哈爾濱師范大學(xué)試驗田種植的紫花首猜的根際，將植物根際±壤裝 入事先準備好的干凈保鮮袋中，帶回實驗室4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0033] 2)菌株的篩選和純化
[0034] 稱取5g±樣，加入盛有玻璃珠和45mL無菌水的錐形瓶中，在培養(yǎng)搖床上劇烈振蕩 30min(37°C)后于80°C的水浴鍋中保持15min。然后用無菌水進行梯度稀釋后涂布于PDA 平板，37°C培養(yǎng)l-2d，取培養(yǎng)基上生長的菌落，純化并得到純培養(yǎng)的菌株。將得到的一株芽 抱桿菌命名為CYY-25。
[0035] 2、菌株CYY-25的鑒定
[0036] 1)分子鑒定
[0037] 對菌株CYY-25進行基因組DNA提取，然后進行16SrDNA的PCR擴增和測序。
[0038] PCR擴增所采用的引物為：
[0041] ?〇?擴增條件為：941：3111111;941：303、551：303、721：903,30個循環(huán)；72°(：10111111， 4°C無限循環(huán)。
[0042] 對PCR擴增產(chǎn)物進行測序，測序結(jié)果如序列表SEQIDNO. 1所示。
[0043] 2)形態(tài)鑒定
[0044] 參見圖1，菌株CYY-25在PDA培養(yǎng)基上形成圓形或不規(guī)則形，乳白色，邊緣不整齊， 表面粗糖的菌落。
[0045] 3)生理生化鑒定結(jié)果如表1 :
W4引注：+，陽性；-，陰性。
[0049] 參見圖7,通過鑒定，菌株CYY-25屬于枯草芽抱桿菌度acillussubtilis)。
[0050] 二、枯草芽抱桿菌CYY-25度acillussubtilis)產(chǎn)嗎I噪乙酸（IAA)的能力
[0051] 采用Sa化OWSki比色法測定菌株CYY-25分泌IAA的能力。CYY-25先在DF液體培 養(yǎng)基中培養(yǎng)2d，再微量轉(zhuǎn)入添加0、200和500ygL-T巧/mL的DF液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng) 2d，測ODe。。值，其余培養(yǎng)液離屯、后，取500yL上清液，加入2血Sa化OWSki試劑迅速充分混 合，室溫暗培養(yǎng)20min后，測0Ds35值。IAA標準曲線平行2次，樣品重復(fù)3次。得到標準曲 線方程如下：y= 0. 0717X-0. 0007 (R2= 0. 999)，其中X代表OD535值，y代表IAA濃度（y g/ mL)。
[0052] 如圖2所示，即為CYY-25菌株的IAA合成量。由圖可知，CYY-25在khp濃度為 0、 200和500yg/mL時，合成IAA量分別為0. 363、6. 765和9. 349yg/mL。該菌株不僅能夠 利用kT巧產(chǎn)生IAA，而且隨著kT巧濃度的增加，其IAA的合成量也增加。 陽化引S、枯草芽抱桿菌CYY-25(Bacillussubtilis)溶解無機憐的能力
[0054]將CYY-25菌株點接種于NBRIP培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)2-3山觀察菌落周圍是否產(chǎn)生 無色透明暈圈。 陽化5] 參照鋼錬抗顯色法來測量CYY-25菌株溶解無機憐的能力。標準曲線平行2 次，樣品重復(fù)5次。根據(jù)測得的ODee。值，繪制標準曲線，得到標準曲線方程如下：y= 1.0104X+0. 0047 (R2= 0. 9974)，其中X代表ODee。值，y代表憐的質(zhì)量濃度（y g/mL)。查標 準曲線，按如下公式進行計算：
[0056]