從_80°C中取出腐敗希瓦氏菌，吸取200 μ 1，用涂布棒均勻涂布在滅菌后的固體污水培養(yǎng)基上，封口膜封嚴(yán)，將平板倒置在25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10h，挑取較大而光滑的單菌落，接種到滅菌后的液體污水培養(yǎng)基中，于25°C搖床中，在轉(zhuǎn)速250rpm，震蕩培養(yǎng)12h左右，檢測腐敗希瓦氏菌的活菌數(shù)，得到菌個數(shù)大于等于5 X 18個/ml菌液；
[0046](2)睪丸酮假單胞菌的培養(yǎng):在室溫，將從-80°C中取出睪丸酮假單胞菌，吸取200 μ 1，用涂布棒均勻涂布在滅菌后的固體污水培養(yǎng)基上，封口膜封嚴(yán)，將平板倒置在25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10h，挑取較大而光滑的單菌落，接種到滅菌后的液體污水培養(yǎng)基中，于25°C搖床中，在轉(zhuǎn)速250rpm，震蕩培養(yǎng)12h左右，檢測睪丸酮假單胞菌的活菌數(shù)，得到菌個數(shù)大于等于5 X 18個/ml菌液；
[0047](3)菌劑制備:將步驟(I)和步驟(2)獲得的菌液按體積比為2:1的比例混合，得到治理污染水體的耐低溫復(fù)合微生物菌劑為E組。
[0048]治理污染水體的耐低溫復(fù)合微生物菌劑以下簡稱復(fù)合菌。
[0049]作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案，污水培養(yǎng)基為在天津海河金鋼橋附近、天津西外環(huán)排污河、天津大學(xué)敬業(yè)湖、天津大學(xué)愛晚湖、污水處理廠等地采集的水樣各IL混合均勻。
[0050]復(fù)合菌的使用條件要求污水pH為6.0-8.00
[0051]實(shí)施例4
[0052]復(fù)合菌(A組，B組和C組)與腐敗希瓦氏菌和睪丸酮假單胞菌COD去除能力的比較
[0053]將復(fù)合菌(A組，B組和C組)、腐敗希瓦氏菌和睪丸酮假單胞菌分別接種于IL污水中，復(fù)合菌與單一菌的接菌總量相同(均為千分之一)，并分別在10°C、15°C、25°C條件下，200rpm/min的搖床中震蕩培養(yǎng)24h后測定COD的去除率。結(jié)果見圖1。
[0054]結(jié)果表明，復(fù)合菌與腐敗希瓦氏菌和睪丸酮假單胞菌相比對污水中COD的去除率存在差異。在10°C、15°C、25°C條件下，按不同比例混合的復(fù)合菌的COD去除率均高于單一菌。而且隨溫度降低，復(fù)合菌的優(yōu)勢呈增大趨勢。此外復(fù)合菌中腐敗希瓦氏菌和睪丸酮假單胞菌按照不同比例混合，COD去除率存在差異。腐敗希瓦氏菌和睪丸酮假單胞菌按照2:1的比例混合，COD的去除率最高，10°C、15°C、25°C條件下分別比腐敗希瓦氏菌單一菌株高48.66%,46.73%, 38.6%，比睪丸酮假單胞菌單一菌株高54.38%, 53.13%, 50.74%。低溫條件下2:1的比例混合菌劑優(yōu)勢更明顯。
[0055]實(shí)驗(yàn)證明，D組和E組的復(fù)合菌降低COD的能力分別與腐敗希瓦氏菌和睪丸酮假單胞菌相比，具有顯著差異。
[0056]實(shí)施例5
[0057]復(fù)合菌(A組，B組和C組)與腐敗希瓦氏菌和睪丸酮假單胞菌氨氮去除能力的比較
[0058]將復(fù)合菌(A組，B組和C組)、腐敗希瓦氏菌和睪丸酮假單胞菌分別接種于IL污水中，復(fù)合菌與單一菌的接菌總量相同(均為千分之一)，分別在10°C、15°C、25°C條件下，200rpm/min的搖床中震蕩培養(yǎng)24h后測定氨氮的去除率。結(jié)果見圖2。
[0059]結(jié)果表明，復(fù)合菌與腐敗希瓦氏菌和睪丸酮假單胞菌相比對污水中氨氮的去除率存在差異。在10°C、15°C、25°C條件下復(fù)合菌的氨氮去除率均高于單一菌，尤其是低溫條件下。此外復(fù)合菌中腐敗希瓦氏菌和睪丸酮假單胞菌按照不同比例混合，氨氮去除率存在差異。25°C條件下，腐敗希瓦氏菌和睪丸酮假單胞菌按照1:2的比例混合，氨氮的去除率最高，為94.2%，按照2:1的比例混合時，氨氮去除率為91.84%,略低于1:2比例混合菌劑的去除率。而在10°C、15°C條件下，腐敗希瓦氏菌和睪丸酮假單胞菌按照2:1的比例混合，氨氮的去除率最高，分別高于1:2比例混合的菌劑17.1%和6.33%。腐敗希瓦氏菌和睪丸酮假單胞菌按照2:1的比例混合，在10°C、15°C、25°C條件下分別比腐敗希瓦氏菌單一菌株高52.38%,49.23%, 50.14%，比睪丸酮假單胞菌單一菌株高39.43%, 30.63%, 30.4%。低溫條件下2:1的比例混合菌劑優(yōu)勢更明顯。
[0060]實(shí)驗(yàn)證3明，D組和E組的復(fù)合菌氨氮去除能力分別與腐敗希瓦氏菌和睪丸酮假單胞菌相比，具有顯著差異。
[0061]綜合考慮，在低溫條件下，腐敗希瓦氏菌和睪丸酮假單胞菌按照2:1的比例混合時，COD和氨氮的去除率最高，污水治理效果最理想。
[0062]實(shí)施例6
[0063]低溫復(fù)合菌最適生長pH測定
[0064]以污水培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基分別調(diào)pH值為5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9，120°(:高壓蒸汽滅菌201^11，冷卻后在超凈臺中把活化后的低溫復(fù)合菌(B組)分別接入其中，接菌量為1%，放置在20°C恒溫?fù)u床中，200rpm/min，培養(yǎng)24h后，分別測定菌液的吸光度，結(jié)果見圖3。
[0065]高濃度的氫離子濃度可導(dǎo)致菌體表面蛋白質(zhì)和核酸水解而變性。不同種屬的微生物生理活動適應(yīng)的pH值，都有一定的范圍。在最低或最高pH值環(huán)境中，微生物雖然能夠成活，但是條件不是最適條件，酶的活性低，生理活動微弱，易于死亡。參與污水生物處理的微生物，一般最佳的pH值范圍，介于6.5?8.5之間。
[0066]從圖3中可以看出，在反應(yīng)時間與接菌量相同的條件下，pH為7.0?7.5時菌液的吸光度最大，生長情況最好，最適pH值在7.5左右，偏堿性，且在pH為6.0?8.0之間吸光度變化細(xì)微，可見該菌劑對PH的適應(yīng)性較好，最佳pH范圍廣，適合作為污水處理的生物菌劑。
[0067]實(shí)施例7
[0068]低溫條件下復(fù)合菌和單一菌生長情況的比較
[0069]本發(fā)明通過光電比濁法測定生長曲線，了解低溫復(fù)合菌的生長規(guī)律，并且與單一菌進(jìn)行對比。選取可見光600nm處，在10°C下培養(yǎng)細(xì)菌，測定培養(yǎng)液的吸光度值，測定時以O(shè)h的培養(yǎng)液為空白，每八個小時測定復(fù)合菌和單一菌菌液的吸光度值，繪制生長曲線，結(jié)果見圖4。
[0070]從圖中可以發(fā)現(xiàn)在10°C條件下低溫復(fù)合菌(B組)生長情況明顯優(yōu)于單一菌腐敗希瓦氏菌、睪丸酮假單胞菌，并且最終生長量明顯高于單一菌。說明低溫條件下，復(fù)合菌具有明顯的生長優(yōu)勢，即復(fù)合菌具有更強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力。
[0071]在廢水處理的實(shí)際生產(chǎn)中，尤其是北方地區(qū)，一年要經(jīng)歷春夏秋冬四季的變化，氣溫經(jīng)歷高溫到低溫的過程，所以研究溫度變化對微生物菌劑的生長影響，進(jìn)而探究溫度變化對水處理工藝的影響尤為重要。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.治理污染水體的耐低溫復(fù)合微生物菌劑，其特征是所述菌劑是按體積比為(1?2): (1?2)的比例由腐敗希瓦氏菌(Shewanella putrefacens)液和睪丸酮假單胞菌(Comamonas testosteroni)液組成，所述腐敗希瓦氏菌液的濃度為IX 10s個/ml_5X 108個/ml，所述睪丸酮假單胞菌液的濃度為IX 10s個/ml-5X 10 8個/ml。2.根據(jù)權(quán)利要求1的治理污染水體的耐低溫復(fù)合微生物菌劑，其特征是所述腐敗希瓦氏菌液和睪丸酮假單胞菌液的體積比為2:1。3.治理污染水體的耐低溫復(fù)合微生物菌劑的制備方法，其特征是包括如下步驟: (1)腐敗希瓦氏菌的培養(yǎng):在室溫，將腐敗希瓦氏菌接種到滅菌后的固體污水培養(yǎng)基中，在15-25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-14h，挑取較大而光滑的單菌落，接種到滅菌后的液體污水培養(yǎng)基中，于15-25°C搖床中，在轉(zhuǎn)速150-250rpm培養(yǎng)至菌個數(shù)達(dá)到IX 10s個/ml_5X10s個/ml的菌液； (2)睪丸酮假單胞菌的培養(yǎng):在室溫，將睪丸酮假單胞菌接種到滅菌后的固體污水培養(yǎng)基中，在15-25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-14h，挑取較大而光滑的單菌落，接種到滅菌后的液體污水培養(yǎng)基中，于15-25 °C搖床中，在轉(zhuǎn)速150-250rpm培養(yǎng)至菌個數(shù)達(dá)到ΙΧΙΟΜ"/ml-5 X 108個/ml的菌液； (3)菌劑制備:將步驟⑴和步驟(2)獲得的菌液，按體積比為(1?2): (1?2)的比例混合，得到治理污染水體的耐低溫復(fù)合微生物菌劑。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的治理污染水體的耐低溫復(fù)合微生物菌劑的制備方法，其特征是所述固體污水培養(yǎng)基由下述組份制成:葡萄糖0.17g，磷酸二氫鉀0.07g，可溶性淀粉0.16g，無水碳酸鈉0.06g，乙酸鈉0.233g，牛肉膏0.06g，氯化銨0.0255g，硫酸銨0.0284g，蛋白胨0.158g，瓊脂粉15g,加水至1L，調(diào)節(jié)pH值6.5?8.5。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的治理污染水體的耐低溫復(fù)合微生物菌劑的制備方法，其特征是所述液體污水培養(yǎng)基由下述組份制成:葡萄糖0.17g，磷酸二氫鉀0.07g，可溶性淀粉0.16g，無水碳酸鈉0.06g，乙酸鈉0.233g，牛肉膏0.06g，氯化銨0.0255g，硫酸銨0.0284g，蛋白胨0.158g，加水至1L，調(diào)節(jié)pH值6.5?8.5。6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的治理污染水體的耐低溫復(fù)合微生物菌劑的制備方法，其特征是所述腐敗希瓦氏菌液和睪丸酮假單胞菌液的體積比為2:1。7.權(quán)利要求1或2治理污染水體的耐低溫復(fù)合微生物菌劑在污染水生態(tài)治理中的應(yīng)用。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述治理為降低C0D，降解氨氮。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種治理污染水體的耐低溫復(fù)合微生物菌劑及制備方法及應(yīng)用，所述菌劑是按體積比為(1～2):(1～2)的比例由腐敗希瓦氏菌液和睪丸酮假單胞菌液組成，本發(fā)明耐低溫復(fù)合微生物菌劑對環(huán)境的適應(yīng)性能力強(qiáng)，尤其是耐低溫，在低溫環(huán)境中也能夠正常生長代謝。利用環(huán)境友好微生物來增強(qiáng)水體的自凈功能，消解河水中污染物以及河底污泥有機(jī)物，防止水體二次污染。使用時直接投放，不需要復(fù)雜的工程工藝，使用方便。本發(fā)明菌劑在低溫條件下有效地降低污水COD和氨氮含量，去除率明顯優(yōu)于單一菌株。
【IPC分類】C12R1/01, C12N1/20, C02F3/34, C02F101/38
【公開號】CN105296398
【申請?zhí)枴緾N201510770303
【發(fā)明人】季靜, 史利平, 王罡, 金超, 尹日暉
【申請人】天津大學(xué)
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2015年11月12日