一種雙特異性抗體活化的t細(xì)胞及制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于細(xì)胞免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種雙特異性抗體活化的T細(xì)胞及制 備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤的過(guò)繼免疫治療是將自體或異體的免疫活性細(xì)胞經(jīng)過(guò)體外擴(kuò)增后輸入患者 體內(nèi)，直接殺傷腫瘤細(xì)胞，調(diào)節(jié)和增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，主要包括LAK細(xì)胞、CD3AK細(xì)胞、TIL 細(xì)胞、CTL細(xì)胞、NK細(xì)胞和CIK細(xì)胞的免疫治療。過(guò)繼免疫治療作為腫瘤綜合治療中的一個(gè) 新方法，已經(jīng)與常規(guī)手術(shù)治療、放療、化療及細(xì)胞因子和分子祀向治療廣泛聯(lián)合，成為腫瘤 綜合治理的一個(gè)組成部分，在多種腫瘤的治療中展示了廣泛的應(yīng)用前景。 陽(yáng)00引其中，T-細(xì)胞（即T淋己細(xì)胞）輸入（trans化Sion)，稱為過(guò)繼T-細(xì)胞療法，已 經(jīng)過(guò)測(cè)試用于癌癥和慢性感染的治療。過(guò)繼T-細(xì)胞療法具有增強(qiáng)抗腫瘤免疫，提高疫苗 效力W及限制移植物抗宿主疾病的潛力。過(guò)繼T-細(xì)胞療法用作細(xì)胞源，尤其是，細(xì)胞毒性 T-細(xì)胞（CTLs),或腫瘤浸潤(rùn)淋己細(xì)胞（TILs)。在現(xiàn)有技術(shù)中常采用雙特異性抗體"武裝 (arm)"(活化的）T-細(xì)胞W形成它們和腫瘤細(xì)胞表面抗原之間的橋梁，W增強(qiáng)T-細(xì)胞的殺 瘤效應(yīng)。雙特異性抗體化ispecificantibody,BiAb)是含有兩種特異性抗原結(jié)合位點(diǎn)的 人工抗體，能在祀細(xì)胞和功能分子（細(xì)胞）之間架起橋梁，使功能分子（細(xì)胞）集中在祀細(xì) 胞周圍，進(jìn)而對(duì)祀細(xì)胞進(jìn)行殺傷，產(chǎn)生祀向性的效應(yīng)功能。BiAb在生物醫(yī)學(xué)中，特別是在腫 瘤的免疫治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。通過(guò)BiAb介導(dǎo)細(xì)胞毒作用殺死腫瘤細(xì)胞是當(dāng)前免 疫治療應(yīng)用研究的熱點(diǎn)之一，其主要特點(diǎn)是BiAb能同時(shí)結(jié)合腫瘤相關(guān)抗原和免疫效應(yīng)細(xì) 胞上的祀分子，直接觸發(fā)免疫效應(yīng)細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷。
[0004] 如中國(guó)專利文獻(xiàn)CN104630146A中公開(kāi)的腫瘤細(xì)胞特異性多克隆T細(xì)胞制備方法 及其應(yīng)用，包括如下步驟：（1)獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞；（2)將獲取的外周血單個(gè)核細(xì)胞與 基因修飾腫瘤細(xì)胞混合；（3)將獲取的混合細(xì)胞重懸于含有能夠維持細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分 化的細(xì)胞因子的培養(yǎng)基中。通過(guò)上述所制備的腫瘤細(xì)胞特異性多克隆T細(xì)胞，主要在預(yù)防 或治療癌癥的藥物中的應(yīng)用，其優(yōu)點(diǎn)在于制備的腫瘤細(xì)胞特異性多克隆T細(xì)胞具有數(shù)量 多、特異性高和殺傷能力強(qiáng)等特性，此外，該制備方法還具有工藝簡(jiǎn)單而且成本較目前特異 性T細(xì)胞制備成本顯著降低。然而，上述方案中通過(guò)雙特異性抗體的連接，使腫瘤細(xì)胞對(duì)T 細(xì)胞進(jìn)行抗原遞呈，然后激活T細(xì)胞，再殺傷祀細(xì)胞，使得制備的腫瘤細(xì)胞特異性多克隆T 細(xì)胞具有特異性高的特點(diǎn)，由于其具有高特異性，則產(chǎn)生特異性殺傷效果，腫瘤細(xì)胞特異性 多克隆T細(xì)胞僅能殺傷祀細(xì)胞，而對(duì)于非祀細(xì)胞則沒(méi)有殺傷作用。 陽(yáng)0化]鑒于現(xiàn)有技術(shù)中還未提出一種方法制備具有擴(kuò)增能力強(qiáng)、細(xì)胞活性強(qiáng)、細(xì)胞毒性 強(qiáng)和細(xì)胞數(shù)量多的具有非特異性殺傷效果的T細(xì)胞。為此，本發(fā)明提供了一種雙特異性抗 體活化的T細(xì)胞及制備方法與應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供了一種雙特異性抗體活化的T細(xì)胞及制 備方法與應(yīng)用。
[0007] 為此，本發(fā)明提供了一種雙特異性抗體活化的T細(xì)胞的制備方法，包括如下步驟：
[000引 S1、取外周全血進(jìn)行離心分離所述外周血中的細(xì)胞和血漿，然后滅活所述血漿中 的補(bǔ)體，收集所述細(xì)胞和血漿，備用；
[0009]S2、將所述步驟Sl中獲得的細(xì)胞稀釋成懸液，分離出單個(gè)核細(xì)胞，然后洗涂，備 用；
[0010] S3、將所述步驟S2中獲得的單個(gè)核細(xì)胞加入無(wú)血清培養(yǎng)液中，向所述無(wú)血清培養(yǎng) 液中加入雙特異性抗體、祀細(xì)胞、能夠維持細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化的細(xì)胞因子和所述步驟Sl 中收集的血漿，隨后按照常規(guī)方法進(jìn)行解育培養(yǎng)，收集培養(yǎng)細(xì)胞，采用生理鹽水離屯、洗涂， 獲得所述的雙特異性抗體活化的T細(xì)胞，即得；
[0011] 其中，所述雙特異性抗體具備活化T細(xì)胞的功能，包含至少一個(gè)祀向T細(xì)胞抗原表 位的結(jié)合位點(diǎn)和至少一個(gè)祀向祀細(xì)胞表面抗原表位的結(jié)合位點(diǎn)；所述雙特異性抗體與所述 T細(xì)胞抗原表位的結(jié)合的解離系數(shù)大于1X10 7,與所述祀細(xì)胞表面抗原表位的結(jié)合的解離 系數(shù)小于5X10 9;所述雙特異性抗體分子量為小于50KD。
[0012] 所述T細(xì)胞抗原為CD3和/或CD28。
[0013] 所述祀細(xì)胞抗原為CD19、CD20和/或腫瘤、微生物的特異性抗原祀點(diǎn)。
[0014] 優(yōu)選的，所述T細(xì)胞抗原為CD3,所述祀細(xì)胞抗原為CD19。
[0015] 所述祀細(xì)胞為滅活的B細(xì)胞、癌細(xì)胞或病原體細(xì)胞。
[0016] 所述的方法，所述祀細(xì)胞為滅活的B細(xì)胞。
[0017] 所述的方法，所述步驟S3中，所述單個(gè)核細(xì)胞的終濃度為化5-2)Xl〇6/ml，加 入的所述雙特異性抗體的終濃度為0.Ing/na-lOOOng/ml，加入的所述祀細(xì)胞的終濃度為 (0. 001-50)Xl〇6/ml，加入的所述血漿的終濃度為0. 1% -10%。 陽(yáng)01引所述的方法，所述步驟S3中，加入的所述細(xì)胞因子為IL-2和IFN- 丫，所述IL-2終 濃度為50-2000U/ml，所述IFN-丫的終濃度為50-3000U/ml。
[0019] 所述的方法，所述步驟S3中，所述解育培養(yǎng)的步驟，培養(yǎng)條件為36-38°C，3-6% CA的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-28天。
[0020] 所述的方法，所述步驟S3中，所述解育培養(yǎng)的步驟中還包括補(bǔ)充培養(yǎng)液的步驟， 所述培養(yǎng)液包括所述IL-2、所述IFN-丫和所述步驟Sl中收集的滅活血漿。
[0021] 所述的方法，所述步驟S3中，所述解育培養(yǎng)的步驟中還包括補(bǔ)充祀細(xì)胞的步驟， 每間隔4-10天適量補(bǔ)充祀細(xì)胞一次。
[0022] 所述的方法，所述步驟Sl中，將分離的所述血漿置于56-6rC下水浴3-30分鐘滅 活補(bǔ)體，優(yōu)選的，于56°c水浴30分鐘，于60°C水浴5分鐘或于ere水浴3分鐘。
[0023] 本發(fā)明提供了一種由上述的方法制備得到的雙特異性抗體活化的T細(xì)胞。
[0024] 本發(fā)明還提供了一種所述的雙特異性抗體活化的T細(xì)胞或其聯(lián)合雙特異性抗體 在制備用于免疫治療、預(yù)防或治療癌癥或治療微生物感染所致疾病的藥物中的用途。
[00巧]在所述的用途中，所述的雙特異性抗體活化的T細(xì)胞制備用于免疫治療、預(yù)防或 治療癌癥或治療微生物感染所致疾病的藥物的方法，包括如下步驟：將所述的雙特異性抗 體活化的T細(xì)胞加入生理鹽水中，并加入添加劑，制成細(xì)胞懸液，即得。
[0026] 在所述的用途中，所述的雙特異性抗體活化的T細(xì)胞聯(lián)合不同抗原祀點(diǎn)的雙特異 性抗體制備用于免疫治療、預(yù)防或治療癌癥或治療微生物感染所致疾病的藥物的方法，包 括如下步驟：取所述的雙特異性抗體活化的T細(xì)胞進(jìn)行洗涂，然后向其中加入適量的與T細(xì) 胞抗原具有高親和力的特定祀標(biāo)的雙特異性抗體，解育培養(yǎng)，然后洗涂，收集細(xì)胞，加入生 理鹽水中，并加入添加劑，制成細(xì)胞懸液，即得。
[0027] 本發(fā)明技術(shù)方案相比現(xiàn)有技術(shù)，具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[002引 1、本發(fā)明所述的雙特異性抗體活化的T細(xì)胞的制備方法，包括如下步驟：S1、取外 周血進(jìn)行離屯、，分離所述外周血中的細(xì)胞和血漿，然后滅活所述血漿中的補(bǔ)體，備用；S2、將 所述步驟Sl中獲得的細(xì)胞稀釋成細(xì)胞懸液，分離出單個(gè)核細(xì)胞，收集單個(gè)核細(xì)胞洗涂，備 用；S3、將所述步驟S2中獲得的單個(gè)核細(xì)胞加入無(wú)血清培養(yǎng)液中，向所述無(wú)血清培養(yǎng)液中 加入雙特異性抗體、祀細(xì)胞、能夠維持細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化的細(xì)胞因子和所述步驟Sl中 收集的血漿，隨后按照常規(guī)方法進(jìn)行解育培養(yǎng)，細(xì)胞數(shù)量能滿足治療的數(shù)量后，并且經(jīng)流式 細(xì)胞儀檢測(cè)獲得的細(xì)胞中不含有祀細(xì)胞時(shí)，離屯、收集細(xì)胞，生理鹽水離屯、洗涂，洗掉雙特異 性抗體，所述的雙特異性抗體活化的T細(xì)胞，即得；其中，所述雙特異性抗體具備活化T細(xì) 胞的功能，包含至少一個(gè)結(jié)合T細(xì)胞抗原表位的結(jié)合位點(diǎn)和至少一個(gè)結(jié)合祀細(xì)胞表面抗原 表位的位點(diǎn)；所述雙特異性抗體與所述T細(xì)胞抗原表位的結(jié)合的解離系數(shù)大于1X10 7,與 所述祀細(xì)胞表面抗原表位的結(jié)合的解離系數(shù)小于1X10 9;所述雙特異性抗體分子量為小 于50KD;通過(guò)在獲取的單個(gè)核細(xì)胞中加入雙特異性抗體，由于該雙特異性抗體分子量小于 50KD，屬于小分子雙特異性抗體，使得其在將效應(yīng)T細(xì)胞與祀細(xì)胞連接在一起時(shí)立即分泌 殺傷性因子殺滅祀細(xì)胞，直接引起效應(yīng)T細(xì)胞對(duì)祀細(xì)胞的殺傷，無(wú)需通過(guò)抗原遞呈作用產(chǎn) 生特異性T細(xì)胞對(duì)祀細(xì)胞進(jìn)行殺傷，同時(shí)還具備活化T細(xì)胞的功能，在殺滅祀細(xì)胞的過(guò)程 中，殺傷性T細(xì)胞的活性、增殖能力和殺傷活性都大幅提高，又由于雙特異性抗體與T細(xì)胞 抗原低親和力，對(duì)祀細(xì)胞是高親和力，運(yùn)種設(shè)計(jì)在保證了雙特異性抗體對(duì)T細(xì)胞活化作用 的同時(shí)，還可W被輕易地洗掉，使得雙特異性抗體可W從T細(xì)胞上脫落，使得T細(xì)胞特異性 殺傷效果喪失，成為非特異性的殺傷細(xì)胞，起著殺滅MHC分子低表達(dá)的腫瘤細(xì)胞，并長(zhǎng)期對(duì) 腫瘤產(chǎn)生細(xì)胞免疫監(jiān)視作用，防止腫瘤再次復(fù)發(fā)，在根除腫瘤方面效果顯著；
[0029] 在使用所述雙特異性抗體活化的T細(xì)胞時(shí)，加入不同類型的對(duì)T細(xì)胞和祀細(xì)胞高 親和力的雙特異性抗體，則所述雙特異性抗體活化的T細(xì)胞產(chǎn)生特異性殺傷效果，效果類 似于CAR-T的作用；若不加入雙特異性抗體，所述雙特異性抗體活化的T細(xì)胞則產(chǎn)生非特 異性殺傷效果，類似于高活性NK或CIK的作用。由于結(jié)合在T細(xì)胞表面的雙特異性抗體 可W被降解和脫落，雙特異性抗體從T細(xì)胞表面消失，此時(shí)的T細(xì)胞喪失了特異性的殺傷 能力，成為非特異性T細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了將所述雙特異性抗體活化的T細(xì)胞的非特異性一一特異 性一一非特異性殺傷的相互之間的轉(zhuǎn)變，既可W顧及特異性祀點(diǎn)的殺傷，也可W產(chǎn)生非特 異性殺傷作用，兼顧到腫瘤的不同特性；
[0030] 所述雙特異性抗體活化的T細(xì)胞結(jié)合高親和力的雙特異性抗體后，其殺傷活性較 CAR-T弱，但安全性遠(yuǎn)高于CAR-T，其操作簡(jiǎn)單，各個(gè)技術(shù)環(huán)節(jié)可控，細(xì)胞質(zhì)量可靠，臨床毒 副作用可控、并且遠(yuǎn)低于CAR-T。W治療B細(xì)胞惡性疾病為例，由于特異性殺傷和非特異性 殺傷之間的轉(zhuǎn)換，大部分病人可W避免B細(xì)胞缺乏，能有效的減少溶瘤綜合癥、細(xì)胞因子風(fēng) 暴和巨隧細(xì)胞活化綜合癥的發(fā)生率和運(yùn)些副作用的嚴(yán)重程度。病人一般不會(huì)有遠(yuǎn)期的不良 反應(yīng)，如永久性B細(xì)胞缺乏癥等；
[0031] 2、本發(fā)明所述的雙特異性抗體活化的T細(xì)胞的制備方法，所述T細(xì)胞抗原為CD3， 所述祀細(xì)胞抗原為CD19,祀向所述T細(xì)胞抗原表位CD3和祀向祀細(xì)胞表面抗原CD19的雙 特異性抗體滿足分子量小于50KD，同時(shí)滿足與所述T細(xì)胞抗原表位的結(jié)合的解離系數(shù)大于 1X10 7,與所述祀細(xì)胞表面抗原表位的結(jié)合的解離系數(shù)小于于1X10 9,屬于小分子雙特異 性抗體，保證其在將效應(yīng)T細(xì)胞與祀細(xì)胞連接在一起時(shí)立即分泌殺傷性因子殺滅祀細(xì)胞， 直接引起效應(yīng)T細(xì)胞對(duì)祀細(xì)胞的殺傷，同時(shí)還具備活化T細(xì)胞的功能，殺傷性T細(xì)胞的活 性、增殖能力和殺傷活性都大幅提高，又由于所述雙特異性抗體與T細(xì)胞抗原低親和力，對(duì) 祀細(xì)胞是高親和力，運(yùn)種設(shè)計(jì)使得所述雙特異性抗體可W從T細(xì)胞上脫落，使得T細(xì)胞特異 性殺傷效果喪失，成為非特異性的殺傷細(xì)胞；
[0032] 3、本發(fā)明所述的雙特異性抗體活化的T細(xì)胞的制備方法，所述祀細(xì)胞為滅活的B 細(xì)胞，臨床安全的基本保障，臨床安全風(fēng)險(xiǎn)較??；
[0033] 4、本發(fā)明所述方法制備的雙特異性抗體活化的T細(xì)胞可單獨(dú)應(yīng)用，也可與雙特性 抗體一起使用制備用于免疫治療、預(yù)防或治療癌癥或治療微生物感染所致疾病的藥物中的 應(yīng)用。