一種人類結(jié)腸癌細(xì)胞系dxh-1及其應(yīng)用
【專利說(shuō)明】
(一)
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種來(lái)源于乙狀結(jié)腸癌病灶的人類結(jié)腸癌細(xì)胞系DXH-1及其培養(yǎng)方法與用途。
(二)
【背景技術(shù)】
[0002]結(jié)直腸癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近幾年來(lái)我國(guó)發(fā)病率呈持續(xù)升高趨勢(shì)。目前公認(rèn)正常腸黏膜-腺瘤-癌的演變史為腸癌發(fā)生演變過(guò)程，APC、K-Ras、TP53、C-MYC等眾多基因參與腸癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，但是目前腸癌發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。
[0003]目前手術(shù)、放化療這些傳統(tǒng)的治療方案仍然是治療結(jié)直腸癌的主要途徑，隨著人類對(duì)結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展研究進(jìn)一步深入，生物靶向治療為結(jié)直腸癌患者帶來(lái)新的希望，但是大多數(shù)晚期患者手術(shù)治愈率低，傳統(tǒng)治療預(yù)后不佳，因而，尋求更多更完善的結(jié)直腸癌治療手段顯得尤為重要。
[0004]近年來(lái)，結(jié)腸癌細(xì)胞作為結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展機(jī)理，免疫治療及藥物研究開(kāi)放的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)材料已經(jīng)被廣泛利用，現(xiàn)有的細(xì)胞系在使用過(guò)程中經(jīng)歷反復(fù)傳代后，細(xì)胞特性與原始腫瘤細(xì)胞相比已產(chǎn)生明顯差異?，F(xiàn)有的人類腸癌細(xì)胞系及其特性尚不能完全滿足關(guān)于結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，仍需要更多不同特性的原代腸癌細(xì)胞株用來(lái)研究大腸癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，而目前我國(guó)至今為之尚未報(bào)道過(guò)直接從腸癌病灶培養(yǎng)得到的原代腸癌細(xì)胞系。針對(duì)日前國(guó)內(nèi)結(jié)直腸癌發(fā)病率日趨升高，建立我國(guó)自己的結(jié)腸癌細(xì)胞系具有更顯著的科學(xué)意義和社會(huì)意義。
[0005]本發(fā)明運(yùn)用臨床手術(shù)切除標(biāo)本直接體外培養(yǎng)細(xì)胞系，利用胰酶時(shí)間差異消化法分離純化出原代腫瘤細(xì)胞系，該細(xì)胞系呈典型的惡性腫瘤表現(xiàn)，可在體外穩(wěn)定傳代，接近于腫瘤的臨床生物學(xué)特征，是研究結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展轉(zhuǎn)移機(jī)制和抗腫瘤免疫治療及藥物篩選的理想實(shí)驗(yàn)材料。
(三)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明目的是提供一種來(lái)源于人類乙狀結(jié)腸癌病灶的人類結(jié)腸癌細(xì)胞系DXH-1，為大腸癌的發(fā)生發(fā)展轉(zhuǎn)移機(jī)制，免疫治療及藥物篩選等研究提供新的人類原代細(xì)胞模型，有助于對(duì)大腸癌的發(fā)生機(jī)制、藥物研究進(jìn)行深入的研究。
[0007]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0008]本發(fā)明提供一種來(lái)源于乙狀結(jié)腸癌病灶的人類結(jié)腸癌細(xì)胞系DXH-1，所述人類結(jié)腸癌細(xì)胞系DXH-1保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào):CCTCC No:C201543，保藏日期:2015年5月13日，地址:中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，430072。
[0009]本發(fā)明所述人類結(jié)腸癌細(xì)胞系DXH-1原代細(xì)胞由如下方法獲得:取病人手術(shù)新鮮手術(shù)標(biāo)本乙狀結(jié)腸癌病灶組織，0.5%聚維酮碘浸泡消毒10分鐘，眼科剪剪碎至1mm3左右，使用膠原酶/透明質(zhì)酸酶消化成單細(xì)胞后，40μπι孔徑濾器過(guò)濾后，直接置入DMEM/F12完全培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)原代細(xì)胞。
[0010]本發(fā)明所述人類結(jié)腸癌細(xì)胞系DXH-1建系及傳代方法如下:原代細(xì)胞培養(yǎng)一周后獲得大腸癌腫瘤細(xì)胞和腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞混合的細(xì)胞群，使用胰酶時(shí)間差消化法，即0.025%胰酶消化5分鐘后去除腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞，重新加入胰酶消化30分鐘后獲取純化的大腸癌腫瘤細(xì)胞DXH-1，此后每3-4天傳代一次。
[0011]本發(fā)明還涉及構(gòu)建所述人類結(jié)腸癌細(xì)胞系DXH-1的方法，所述方法包括:取乙狀結(jié)腸癌原位灶組織，剪碎后用膠原酶/透明質(zhì)酸酶消化成單個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)一周后獲得大腸癌腫瘤細(xì)胞和腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞混合的細(xì)胞群。使用胰酶時(shí)間差消化法，即0.025%胰酶消化5分鐘后去除腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞，重新加入胰酶消化30分鐘后獲取純化的人類結(jié)腸細(xì)胞系DXH-1，可在體外繼續(xù)培養(yǎng)到50代以上。
[0012]具體的，所述構(gòu)建所述人類結(jié)腸癌細(xì)胞系DXH-1的方法如下:
[0013](1)取乙狀結(jié)腸癌原位灶組織，0.5%聚維酮碘浸泡消毒10分鐘，PBS沖洗二次去除消毒液；
[0014](2)將消毒后的組織置于潔凈的培養(yǎng)皿，用眼科剪將其剪碎至大小1_左右碎塊，加入至膠原酶/透明質(zhì)酸酶消化液中消化；
[0015](3)將上述消化液置于37°C孵箱，150rpm振蕩消化1小時(shí)獲得單細(xì)胞懸液；
[0016](4)將步驟(3)消化獲取的單細(xì)胞懸液，經(jīng)40 μm孔徑濾器過(guò)濾后，接種至DMEM/F12培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24小時(shí)后，將培養(yǎng)基吸去后，重新加入新鮮DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)約一周;
[0017](5)當(dāng)培養(yǎng)至所有混合細(xì)胞群長(zhǎng)至瓶底80%時(shí)，吸去培養(yǎng)基，加入0.025%胰酶消化5分鐘后，棄去此時(shí)消化下來(lái)的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞，重新加入胰酶消化剩余貼壁細(xì)胞30分鐘后，加入培養(yǎng)基中和，1000g 5分鐘離心，再種入新的培養(yǎng)瓶中貼壁培養(yǎng)，此即人類結(jié)腸細(xì)胞系DXH-1，標(biāo)記傳代次數(shù)為P0 ;
[0018](6) DXH-1細(xì)胞按照1:3傳代，每3_4天傳代一次，細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定，體外可繼續(xù)傳代50次以上。
[0019]本發(fā)明還提供所述的人類結(jié)腸癌細(xì)胞系DXH-1在作為人結(jié)直腸癌發(fā)生、人結(jié)直腸癌發(fā)展或人結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的細(xì)胞模型中的應(yīng)用。
[0020]本發(fā)明涉及所述的人類結(jié)腸癌細(xì)胞系DXH-1在建立人結(jié)直腸癌動(dòng)物模型中的應(yīng)用。
[0021]本發(fā)明涉及所述的人類結(jié)腸癌細(xì)胞系DXH-1在研究人結(jié)直腸癌發(fā)生機(jī)理和/或治療人結(jié)直腸癌藥物中的應(yīng)用。
[0022]本發(fā)明所述的人類結(jié)腸癌細(xì)胞系DXH-1的用途，是指腫瘤基礎(chǔ)科學(xué)研究，臨床應(yīng)用研究以及創(chuàng)新治療的研發(fā)等方面，包括但不限于:
[0023](1)研究人結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)機(jī)制；
[0024](2)研究人結(jié)直腸癌耐藥機(jī)制；
[0025](3)篩選人結(jié)直腸癌相關(guān)生物標(biāo)志物；
[0026](4)構(gòu)建人結(jié)直腸耐藥細(xì)胞模型；
[0027](5)構(gòu)建人結(jié)直腸癌動(dòng)物模型；
[0028](6)篩選人結(jié)直腸癌的抗癌藥物；
[0029](7)篩選開(kāi)發(fā)人結(jié)直腸癌免疫治療疫苗。
[0030]本發(fā)明所述人類結(jié)腸癌細(xì)胞系DXH-1的生物學(xué)相關(guān)特性，其主要特性體現(xiàn)在:
[0031]1、DXH-1細(xì)胞是從乙狀結(jié)腸癌病灶取材建立的細(xì)胞系，在體外一般培養(yǎng)條件就能使細(xì)胞存活并傳代，現(xiàn)已穩(wěn)定傳代50代以上，為大腸癌機(jī)制及藥物篩選提供適宜材料；
[0032]2、DXH-1在體內(nèi)裸鼠實(shí)驗(yàn)中有較強(qiáng)的成瘤能力，1*106細(xì)胞種入裸鼠皮下，35天即可(5/5) 100% 成瘤;
[0033]3、DXH-1 細(xì)胞系為 MMR 突變細(xì)胞系，TP53 (-)，K-RAS、B-RAF、PTEN、TP53 等相關(guān)基因的突變情況詳見(jiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
[0034]4、DXH-1細(xì)胞對(duì)結(jié)直腸癌化療藥物(5FU，奧沙利鉑和伊立替康等)有一定的耐藥性，為研究結(jié)直腸癌化療藥耐藥機(jī)制提供材料。
[0035]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明提供一種來(lái)源于乙狀結(jié)腸癌病灶的人類結(jié)腸癌細(xì)胞系DXH-1及其作為人結(jié)直腸癌發(fā)生、人結(jié)直腸癌發(fā)展或人結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的細(xì)胞模型中的應(yīng)用，在建立人結(jié)直腸癌動(dòng)物模型中的應(yīng)用，在研究人結(jié)直腸癌發(fā)生機(jī)理和/或治療人結(jié)直腸癌藥物中的應(yīng)用；本發(fā)明人類結(jié)腸癌細(xì)胞系DXH-1能夠穩(wěn)定傳代50代以上，為大腸癌機(jī)制及藥物篩選提供適宜材料；在體內(nèi)裸鼠實(shí)驗(yàn)中有較強(qiáng)的成瘤能力，1*106細(xì)胞種入裸鼠皮下，35天即可(5/5) 100%成瘤；DXH_1細(xì)胞對(duì)結(jié)直腸癌化療藥物(5FU，奧沙利鉑和伊立替康等)有一定的耐藥性，為研究結(jié)直腸癌化療藥耐藥機(jī)制提供材料。
(四)
【附圖說(shuō)明】
[0036]圖1:分離出穩(wěn)定傳代第15代原代人結(jié)腸癌細(xì)胞系DXH-1在DMEM/F12培養(yǎng)基下生長(zhǎng)第3天，克隆球形成。
[0037]圖2:裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，1*106細(xì)胞裸鼠皮下生長(zhǎng)35天后即可(5/5) 100%成瘤。
[0038]圖3:裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，DXH-1細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)曲線。
[0039]圖4:裸鼠體內(nèi)成瘤組織的病理照片。
[0040]圖5:裸鼠移植瘤MMR相關(guān)基因免疫組化結(jié)果。
[0041]圖6:DXH-1細(xì)胞系的基因突變檢測(cè)。
[0042]圖7:DXH_1細(xì)胞系對(duì)5FU、奧沙利鉬(Oxaliplatin)及伊立替康(Irrinotecan)等臨床常用結(jié)直腸癌藥物的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
(五)
【具體實(shí)施方式】
[0043]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此:
[0044]實(shí)施例1
[0045]一、材料:
[0046]1、細(xì)胞培養(yǎng)液的配置方法
[0047]1.1培養(yǎng)液，DMEM/F12完全培養(yǎng)基組成如下:10% (v/v)胎牛血清(澳洲Gibico公司)，100U/ml丙酮酸，100U/ml非必需氨基酸，100U/ml谷氨酰胺，100U