一種褐藻膠裂解酶基因algp及其制備方法與表達(dá)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種褐藻膠裂解酶基因algp及 其制備方法與表達(dá)。
【背景技術(shù)】
[0002] 廣轟無(wú)巧的海洋占據(jù)著地球71%的面積，是一個(gè)巨大的寶庫(kù)，蘊(yùn)藏的巨量的生物 資源。海藻是其中一種重要的海洋植物，它是無(wú)機(jī)物的天然富集器，也是許多海洋活性物質(zhì) 的制造者。海藻多糖就是海藻中的一大類(lèi)重要活性物質(zhì)，目前國(guó)際上應(yīng)用最廣泛最多的海 藻多糖是褐藻膠，卡拉膠和瓊膠。
[0003] 褐藻膠是源自于褐藻植物的細(xì)胞壁的水溶性酸性多糖，其主要由aA-古羅糖醒 酸和目-D-甘露糖醒酸組成。隨著研究的發(fā)現(xiàn)，褐藻膠的降解產(chǎn)物具有特別的化學(xué)活性與 生物活性，在醫(yī)藥衛(wèi)生、食品工業(yè)及化妝品行業(yè)等均存在巨大的應(yīng)用價(jià)值。制備褐藻膠降解 產(chǎn)物有多種方法，如酸法降解、超聲降解、氧化降解、酶降解法等。其中酶法降解相較于化學(xué) 法制備反應(yīng)溫和、易于控制，耗能低，產(chǎn)物回收率較高W及不會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的污染等優(yōu)點(diǎn)，更 多的研究聚焦于酶法降法制備褐藻膠低聚糖。
[0004] 但是，目前由于大多數(shù)產(chǎn)褐藻膠裂解酶的菌株的活性較低，產(chǎn)量較低，阻礙了褐藻 膠低聚糖的制備，進(jìn)一步阻礙了研究與應(yīng)用的深入進(jìn)展。
[0005] 因此，開(kāi)發(fā)活性高、產(chǎn)量高的褐藻膠裂解酶、提高產(chǎn)褐藻膠裂解酶的菌株的活性成 為了本技術(shù)領(lǐng)域的當(dāng)務(wù)之急。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種褐藻膠裂解酶基因algp及其制備方法與表達(dá)。
[0007] 在本發(fā)明的第一方面，提供一種褐藻膠裂解酶，其是：
[000引 （a)SEQIDNO: 2所示的氨基酸序列的多膚；或
[0009] 化）將SEQIDNO:2所示氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)（如1-20個(gè)；較佳地1-10 個(gè)；更佳地1-5個(gè)）氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有（a)多膚活性的由（a) 衍生的多膚；
[0010] (C)氨基酸序列與（a)限定的多膚的氨基酸序列有90%W上（較佳地95%W上； 更佳地98%W上；更佳地99%W上）相同性且具有（a)多膚活性的多膚；或
[0011] (d)具有（a)多膚功能的SEQIDNO:2的蛋白片段。
[0012] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的褐藻膠裂解酶來(lái)源于海洋弧菌（VibrioSP.)QY102。
[0013] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種分離的多核巧酸，該多核巧酸編碼所述的褐藻膠 裂解酶的多核巧酸。
[0014] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的多核巧酸的核巧酸序列如SEQIDNO: 1所示。
[0015] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種表達(dá)載體，它含有所述的多核巧酸。
[0016] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的表達(dá)載體來(lái)源于pet28。
[0017] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，它含有所述的載體，或基 因組中整合有所述的多核巧酸。
[0018] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞，較佳地為大腸桿菌細(xì)胞，更佳地為 HMS174值E3)。
[0019] 在本發(fā)明的另一方面，提供所述的褐藻膠裂解酶的用途，用于酶解褐藻膠。
[0020] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種生產(chǎn)褐藻膠裂解酶的方法，包括步驟：
[0021] (1)培養(yǎng)所述的宿主細(xì)胞，獲得培養(yǎng)物；和
[0022] (2)從培養(yǎng)物中分離褐藻膠裂解酶。
[0023] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞，所述的方法包括：
[0024] 使所述宿主細(xì)胞在化發(fā)酵罐中采用發(fā)酵培養(yǎng)基生長(zhǎng)，生長(zhǎng)到ODe。。= 3 + 0. 5時(shí)， 開(kāi)始補(bǔ)稀料，根據(jù)溶氧反饋緩慢提升補(bǔ)料速率，待1+0.2L稀料補(bǔ)完換成濃料進(jìn)行補(bǔ)料；整 個(gè)發(fā)酵過(guò)程控制溶氧在30 + 10% (較佳地30 + 5% );菌體生長(zhǎng)到ODe。。= 40 + 3時(shí)暫停補(bǔ) 料，此時(shí)溶氧迅速回升，待停補(bǔ)料約IOmin后進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)，添加IPTG后維持30 ± 5min后 再進(jìn)行補(bǔ)料，待菌體生長(zhǎng)緩慢、酶活不再增長(zhǎng)后停止發(fā)酵。
[00巧]在另一優(yōu)選例中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組分為；酵母粉2g/l，甘油5g/l，泡敵 60U1/L，胞2冊(cè)〇46g/L，KH2PO43g/L，畑典1Ig/L，化Cl0. 5g/L，M拆〇40. 5g/L，CaClz溶液 2ml/L，微量元素2ml/L;
[0026] 所述的稀料的組分為；蛋白腺20g/L，酵母粉lOg/L，甘油60g/L，M拆O4I. 25g/L;
[0027] 所述的濃料的組分為；蛋白腺80g/l，酵母粉40g/l，甘油240g/L，M拆〇45g/L;
[0028] 所述各組分的用量在所指定數(shù)值基礎(chǔ)上可浮動(dòng)±20% (較佳地，浮動(dòng)±10% ;更 佳地，浮動(dòng)±5% )。
[0029] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于酶解褐藻膠的試劑盒，所述的試劑盒中包含 所述的褐藻膠裂解酶。
[0030] 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn) 的。
【附圖說(shuō)明】
[0031] 圖1、褐藻膠裂解酶基因al甜的核巧酸序列。
[0032] 圖2、根據(jù)褐藻膠裂解酶基因algp的核巧酸序列推測(cè)的氨基酸序列。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 本發(fā)明人經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的研究，首次掲示了一種海洋弧菌（VibrioSP.)QY102來(lái)源的 褐藻膠裂解酶，其編碼基因命名為algp。本發(fā)明的褐藻膠裂解酶蛋白穩(wěn)定性好，生物活性 高。本發(fā)明還公開(kāi)了含有algp基因的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞，W及表達(dá)該褐藻膠裂解酶的方 法。根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案，可W實(shí)現(xiàn)W較低的成本大量生產(chǎn)重組褐藻膠裂解酶。
[0034] 如本文所用，所述的"褐藻膠裂解酶活性"是W酶的活力單位來(lái)定義的。酶活力單 位扣）定義為；在實(shí)驗(yàn)條件下，每分鐘催化底物產(chǎn)生Iyg還原糖所需的酶量。發(fā)酵液酶活 力單位定義為；每毫升發(fā)酵液含酶活單位扣/ml)。
[0035] 如本文所用，"分離的"是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(lái)（如果是天然的物質(zhì)，原 始環(huán)境即是天然環(huán)境）。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核巧酸和多膚是沒(méi)有分離純化 的，但同樣的多聚核巧酸或多膚如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開(kāi)，則為分離純化 的。
[0036] 如本文所用，"分離的褐藻膠裂解酶或多膚（蛋白）"是指褐藻膠裂解酶基本上不 含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類(lèi)、糖類(lèi)或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì) 純化技術(shù)純化褐藻膠裂解酶。基本上純的多膚在非還原聚丙帰醜胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主 帶。
[0037] 本發(fā)明的褐藻膠裂解酶多膚可W是重組多膚、天然多膚、合成多膚。本發(fā)明的多膚 可W是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從宿主（例如，細(xì)菌、酵母、 高等植物、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞）中產(chǎn)生。
[0038] 本發(fā)明還包括褐藻膠裂解酶的片段、衍生物和類(lèi)似物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"片段"、 "衍生物"和"類(lèi)似物"是指基本上保持本發(fā)明的天然褐藻膠裂解酶相同的生物學(xué)功能或活 性的多膚。本發(fā)明的多膚片段、衍生物或類(lèi)似物可W是（i)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性 氨基酸殘基（優(yōu)選保守性氨基酸殘基）被取代的多膚，而送樣的取代的氨基酸殘基可W是 也可W不是由遺傳密碼編碼的，或（ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多膚， 或（iii)附加的氨基酸序列融合到此多膚序列而形成的多膚（如前導(dǎo)序列或分泌序列或用 來(lái)純化此多膚的序列或蛋白原序列，或融合蛋白）。根據(jù)本文的定義送些片段、衍生物和類(lèi) 似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
[0039] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"褐藻膠裂解酶"指具有裂解褐藻膠的活性的SEQIDNO:2序列 的多膚。該術(shù)語(yǔ)還包括具有與褐藻膠裂解酶相同功能的、SEQIDN0:2序列的變異形式。送 些變異形式包括（但并不限于）；若干個(gè)（通常為1-20個(gè)，更佳地1-10個(gè)，還更佳如1-8 個(gè)、1-5個(gè)、1-3個(gè)、或1-2個(gè)）氨基酸的缺失、插入和/或取代，W及在C末端和/或N末端 添加或缺失一個(gè)或數(shù)個(gè)（通常為20個(gè)W內(nèi)，較佳地為10個(gè)W內(nèi)，更佳地為5個(gè)W內(nèi)）氨基 酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功 能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì) 的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括褐藻膠裂解酶的活性片段和活性衍生物。
[0040] 多膚的變異形式包括：同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突 變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與褐藻膠裂解酶DNA雜交的DNA所編碼的蛋白。本發(fā)明 還提供了其他多膚，如包含褐藻膠裂解酶或其片段的融合蛋白。
[0041] 發(fā)明還提供褐藻膠裂解酶或多膚的類(lèi)似物。送些類(lèi)似物與天然褐藻膠裂解酶的差 別可W是氨基酸序列上的差異，也可W是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。 送些多膚包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可W通過(guò)各種技術(shù)得到，如通過(guò)福射 或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過(guò)定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類(lèi) 似物還包括具有不同于天然k氨基酸的殘基（如D-氨基酸）的類(lèi)似物，W及具有非天然 存在的或合成的氨基酸（如目、Y-氨基酸）的類(lèi)似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多膚并不限于上 述例舉的代表性的多膚。
[0042] 在本發(fā)明中，"褐藻膠裂解酶保守性變異多膚"指與SEQIDNO:2的氨基酸序列相 比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)，最佳地至多3個(gè)（如1個(gè)、2個(gè)