一種制備高效水解活力施氏假單胞菌的細(xì)胞固定化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種制備高效水解活力施氏假單胞菌的細(xì)胞固定化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]固定化細(xì)胞技術(shù)是用于獲得細(xì)胞的酶和代謝產(chǎn)物的一種方法，是在固定化酶的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新技術(shù)。由于固定化細(xì)胞能進(jìn)行正常的生長(zhǎng)、繁殖和新陳代謝，所以又稱固定化活細(xì)胞或固定化增殖細(xì)胞。通過各種方法將細(xì)胞和水不溶性載體結(jié)合，制備固定化細(xì)胞的過程稱為細(xì)胞固定化。
[0003]與游離的細(xì)胞相比，固定化的細(xì)胞具有顯著的優(yōu)點(diǎn):1)固定化可以提高菌體的穩(wěn)定性；2)固定化細(xì)胞易于分離進(jìn)而簡(jiǎn)化產(chǎn)物的分離純化；3)可以獲得更高的細(xì)胞濃度；4)細(xì)胞的種類多種多樣，大小和特性各不相同，故此細(xì)胞固定化的方法有很多種，固定化的方法主要有吸附法、包埋法、交聯(lián)法。吸附法是利用各種吸附劑，將細(xì)胞吸附在其表面而使細(xì)胞固定的方法，用于細(xì)胞固定化的吸附劑主要有硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料、金屬絲網(wǎng)、微載體和中空纖維等。包埋法是將細(xì)胞包埋在多空載體內(nèi)部而制成固定化細(xì)胞的方法，可分為凝膠包埋法和半透膜包埋法。交聯(lián)法是依靠雙功能團(tuán)試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)凝集成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使之不溶于水從而形成固定化酶，常采用的雙功能團(tuán)試劑有戊二醛、順丁烯二酸酐等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的在于進(jìn)一步優(yōu)化現(xiàn)有技術(shù)，提供一種高效水解活力施氏假單胞菌細(xì)胞的固定化方法。
[0005]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):
一種制備高效水解活力施氏假單胞菌的細(xì)胞固定化方法，包括以下步驟:
(1)施氏假單胞菌經(jīng)活化培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)得到菌液，菌液離心分離得菌體，菌體干燥備用；
(2)將步驟(1)得到的菌體接入經(jīng)高壓滅菌冷卻的海藻酸鈉與PVA的混合溶液中，混勻后注入攪拌的飽和硼酸_CaCl2溶液中固定化，過濾得到小珠后用蒸餾水洗滌，再經(jīng)冷凍干燥制得固定化施氏假單胞菌細(xì)胞催化劑。
[0006]進(jìn)一步地，步驟(1)所述施氏假單胞菌為stutzeri GIM1.273，購自廣東省微生物研究所。
[0007]進(jìn)一步地，步驟(1)所述發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基中各成分的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為:葡萄糖0.1 %~5 %，酵母浸膏 0.1 %~5 %，(NH4)2S04 0.2 %~3 % g，Κ2ΗΡ04 0.02 %~1 %g，MgS04.7H20
0.002 %~0.2 %，其余成分為水；培養(yǎng)基中初始pH值為6.0-8.0。
[0008]進(jìn)一步地，步驟(1)所述發(fā)酵培養(yǎng)條件為溫度20 °C -40 °C，轉(zhuǎn)速120~200 r/min，震蕩培養(yǎng)0.5 d~3 do
[0009]進(jìn)一步地，所述細(xì)胞固定化采用包埋法-交聯(lián)法聯(lián)合使用的方法。
[0010]進(jìn)一步地，步驟(2)所述的海藻酸鈉與PVA在混合溶液中的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)分別為0.5 %~8 % 與 0 %~12 %。
[0011]進(jìn)一步地，步驟(2)所述的海藻酸鈉與PVA的混合溶液為固定化載體，其中固定化載體與施氏假單胞菌干重比為(50 ~ 250): 1。
[0012]進(jìn)一步地，步驟(2)所述的飽和硼酸_CaCl2溶液為交聯(lián)劑，所述交聯(lián)劑中CaCl 2濃度為0.05 mol/L~l.0 mol/L，硼酸為飽和硼酸溶液。
[0013]進(jìn)一步地，步驟(2)所述固定化的溫度為0 °C~ 10 °C，固定化的時(shí)間為0.5 h~24
ho
[0014]進(jìn)一步優(yōu)化地，本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
(1)施氏假單胞菌的獲取:將施氏假單胞菌活化后接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，接種量為1%~10 % (v/v)，培養(yǎng)溫度為25 °C -40 °C，轉(zhuǎn)速為120~200 rpm，培養(yǎng)時(shí)間為12 h~72 h，高速冷凍離心分離得到菌體，離心溫度為0°C ~12°C，轉(zhuǎn)速為8000 rpm~13000 rpm,經(jīng)真空冷凍干燥6~48 h，懸浮于生理鹽水中；
(2)配制海藻酸鈉與PVA的混合溶液，并進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，滅菌條件是121°C, 10-30min，冷卻備用；
(3 )將步驟(1)所得菌懸液加入步驟(2 )所得的混合溶液中，渦旋振蕩混勻，得混合物；
(4)用注射器將步驟(3)得到的混合物勻速注入硼酸-CaCl2S液中，0 °C~ 4 °C下固定化0.5 h~24 h，過濾干燥制得施氏假單胞菌固定化細(xì)胞；
進(jìn)一步地，步驟(1)所述的施氏假單胞菌活化培養(yǎng)的具體操作為:從試管保存的菌種中挑1~2環(huán)至50~200 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25~40°C，培養(yǎng)時(shí)間為6h~48 h ；
進(jìn)一步地，步驟(1)所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為葡萄糖0.1 %~5 % (w/v，下同)，酵母浸膏0.1%~5 %，(NH4)2S04 0.2 %~3 % g, Κ2ΗΡ04 0.02 %~1 %g, MgS04*7H20 0.002 %~0.2 %，其余成分為水；初始pH值6.0 ~ 8.0，培養(yǎng)溫度為25~40°C，培養(yǎng)時(shí)間為6 h~48 h ；
進(jìn)一步地，步驟(2)所述的海藻酸鈉與PVA的混合溶液為固定化載體，其中各物質(zhì)的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)分別為:海藻酸鈉0.5 %~8 %、PVA 0 %~12 % ；
進(jìn)一步地，步驟(3)的固定化載體與菌體干重比為(50 ~ 250): 1 ；
進(jìn)一步地，步驟(4)所述的硼酸-CaC12溶液為飽和硼酸和0.05-1.0 mol/L CaCl2S
液；
進(jìn)一步地，步驟(4)所述的固定化過程中需慢速攪拌硼酸_CaCl2溶液；
進(jìn)一步地，步驟(4)所述的干燥方法為真空冷凍干燥，干燥時(shí)間為6 h~48 ho
[0015]本發(fā)明具有以下的優(yōu)點(diǎn):
1、本發(fā)明制備固定化細(xì)胞生物制劑的方法簡(jiǎn)便，聯(lián)合采用了包埋法和交聯(lián)法，細(xì)胞不易滲透，并且傳質(zhì)性能好，同時(shí)增加了機(jī)械強(qiáng)度。
[0016]2、本發(fā)明制備的固定化細(xì)胞具有處理效率高、水解活性高、穩(wěn)定性強(qiáng)、易于分離回收循環(huán)利用等優(yōu)點(diǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0017]
為更好理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步地詳細(xì)說明，需要說明的是，這些實(shí)施例并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。
[0018]實(shí)施例1
將Pseudomoms stutzeri GIM1.273 (購自廣東省微生物研究所)種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為1 % (v/v), 35 °C，150 rpm條件下培養(yǎng)24 h，在10 °C下以8000 rpm離心10 min后得到所需菌體，真空冷凍干燥24 h。固定化載體為100mL海藻酸鈉和PVA的混合溶液，其中海藻酸鈉的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為2%，PVA的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為5%，固定化載體經(jīng)高壓蒸汽滅菌后冷卻至室溫，按固定化載體:施氏假單胞菌干重=100:1加入菌粉，渦旋振蕩混勻后用注射器勻速注入200mLCaCl2濃度為0.3 mol/L的飽和硼酸-CaCl 2溶液中，4°C固定化6 h，得到的小珠經(jīng)100目濾布過濾后，用蒸餾水洗去表面未固定的細(xì)胞和Ca2+，干燥，得到淺黃色小珠，為固定化施氏假單胞菌細(xì)胞催化劑。
[0019]菌種培養(yǎng)方法:種子培養(yǎng)基，營(yíng)養(yǎng)肉湯；發(fā)酵液培養(yǎng)基(w/v)為1 %葡萄糖，1 %酵母浸膏，1.2 %(NH4)2S04，0.1 % Κ2ΗΡ04，0.01 % MgS04.7H20，其余成分為水；pH 為 7.0 土
0.Ιο
[0020]采用以下方法測(cè)定固定化施氏假單胞菌細(xì)胞催化劑的水解活力，包括以下操作:在10 mL反應(yīng)瓶中加入0.6 mL磷酸緩沖鹽溶液(PBS，50 mM, pH 8.0),0.1 mL溶于異丙醇的p-NPP溶液，混合均勾，再置于40°C，180 rpm預(yù)熱5 min,加入50 mg上述所得固定化施氏假單胞菌細(xì)胞催化劑，40 °C，180 rpm反應(yīng)10 min，立即加入Na2C03溶液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)A4(]5，該吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程后，可計(jì)算出待測(cè)樣品中的水解活力，單位為U/
mg ο
[0021 ] 按照上述的方法檢測(cè)固定化施氏假單胞菌細(xì)胞催化劑的水解活力，同時(shí)檢測(cè)市面買的固定化酶Novozyme 435的水解活力。最終檢測(cè)到固定化施氏假單胞菌細(xì)胞催化劑的水解酶活為4.23 U/mg，Novozyme435的水解活力為2.44 U/mg。
[0022]實(shí)施例2
'洛Pseudomonas stutzeri GIM1.273 (購自廣東省微生物研究所)種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為4 % (v/v)，發(fā)酵液培養(yǎng)基(w/v)為5 %葡萄糖，5 %酵母浸膏，3 %(NH4)2S04, 0.08 % K2HP04, 0.1 % MgS04.7H20，其余成分為水；pH 為 8.0 ± 0.1。25 °C，150 rpm條件下培養(yǎng)60 h，在4 °C下以10000 rpm離心10 min后得到菌體，真空冷凍干燥12 h，懸浮于生理鹽水中。
[0023]本實(shí)施例固定化載體滅菌處理的具體步驟與實(shí)施例1相同，不同之處在于，本實(shí)施例海藻酸鈉的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)不同，以說明海藻酸鈉的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)對(duì)固定化細(xì)胞水解活力的影響。具體操作如下，按上述要求完成施氏假單胞菌的收集及菌懸液的制備后，配制lOOmLPVA質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為2%的混合溶液，按固定化載體:施氏假單胞菌干重=100:1加入菌粉，再分別配制海藻酸鈉不同質(zhì)量體積濃度(0.5 °/『8 %)的海藻酸鈉與PVA的混合溶液，10 °C下在200mL1.2 mol/L的飽和硼酸_CaCl2溶液中固定化2 h，其他的固定化步驟按實(shí)施例1進(jìn)行，制得固定化施氏假