以硫磺菌蘑菇凝集素n-乙酰氨基乳糖胺結(jié)合域作為融合標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白表達(dá)與純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種W硫橫菌磨茹凝集素N-乙酷氨基 乳糖胺結(jié)合域作為融合標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白表達(dá)與純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著基因工程技術(shù)、基因組學(xué)和蛋白質(zhì)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，重組蛋白已經(jīng)廣泛應(yīng)用于 生物、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和畜牧獸醫(yī)等多種領(lǐng)域。然而，大規(guī)模生產(chǎn)和純化性狀確切的蛋白仍然是 重組蛋白技術(shù)中的難點(diǎn)。重組蛋白的表達(dá)系統(tǒng)有原核和真核兩大類。真核表達(dá)體系有酵母、 昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系等。相對(duì)于真核表達(dá)體系的繁瑣過程和較高的成本，W大腸 桿菌為代表的原核表達(dá)體系具有宿主菌背景清晰、表達(dá)量高、易于操作和生產(chǎn)成本低等諸 多優(yōu)點(diǎn)。
[0003] 在規(guī)模化生產(chǎn)重組蛋白過程中，合適的融合標(biāo)簽對(duì)于目標(biāo)蛋白的可溶性表達(dá)和下 游的蛋白純化與檢測(cè)均具有舉足輕重的作用。常用的融合標(biāo)簽包括蛋白質(zhì)標(biāo)簽和多膚片段 標(biāo)簽。大的蛋白質(zhì)標(biāo)簽有谷脫甘膚S-轉(zhuǎn)移酶（GST)，麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP)，硫氧還原蛋白 A(TrxA),葡萄球菌蛋白A(SPA),小泛素相關(guān)修飾蛋白（SUMO)等，它們的使用會(huì)增加目標(biāo)蛋 白的溶解性，但在蛋白結(jié)晶和抗體產(chǎn)生等過程中，標(biāo)簽必須去除。常見的小的多膚標(biāo)簽有六 聚組氨酸化X化S)、流感病毒血凝素表位（HA)、人c-myc蛋白表位（c-myc)、W及8個(gè)氨基 酸值Y邸孤DK)組成的一個(gè)短膚FLAG標(biāo)簽等。利用上述標(biāo)簽，可W通過親和層析技術(shù)純化 目標(biāo)蛋白。雖然運(yùn)些標(biāo)簽各具優(yōu)點(diǎn)并得到廣泛應(yīng)用，但在規(guī)模化制備和純化蛋白時(shí)，仍存在 成本高的缺點(diǎn)。因此，研究和開發(fā)新的融合標(biāo)簽用于蛋白質(zhì)的高效表達(dá)和純化仍然很有必 要。
[0004] 凝集素是各種植物，無脊椎動(dòng)物和高等動(dòng)物均存在的一類對(duì)糖蛋白上的糖鏈具 有高度特異性的結(jié)合蛋白?？蓪Ｒ蛔R(shí)別某種糖并與之非共價(jià)地、可逆地結(jié)合，如刀豆素與 a-D-化喃糖基甘露糖（a-D-Mannopyranosy)結(jié)合；麥芽素與N-乙酷糖胺（N-acet^ glucosamine)結(jié)合；菜豆凝集素與N-乙酷乳糖胺結(jié)合。利用凝集素與某種糖特異、可逆結(jié) 合的特性，在實(shí)驗(yàn)室中，將凝集素與固相載體結(jié)合來純化各種糖類和糖蛋白，同時(shí)也用偶聯(lián) 于固相介質(zhì)上的某種糖來純化凝集素。1994年Konska等人從硫橫菌中分離出能特異性結(jié) 合N-乙酷氨基乳糖的溶血性凝集素--硫橫磨茹菌凝集素化onskaG,GuillotJ,Dusser M,etal.IsolationandCharacterizationofanN-Acetyllactosamine-BindingLectin fromtheMushroomLaetiporussulfurous.JBiochem, 1994, 116(3):519-23),Hiroaki 等研究發(fā)現(xiàn)該凝集素可W結(jié)合瓊脂糖（Se地arose),并能用乳糖競(jìng)爭(zhēng)性洗脫（Tateno H,GoldsteinIJ.Molecularcloning,expression,andcharacterizationofnovel hemolyticlectinsfromthemushroomLaetiporussulphureus,whichshowhomology tobacterialtoxins.JBiolChem. 2003, 278 (42): 40455-40463)。因此，本研究擬在利用 硫橫菌磨茹凝集素作為蛋白表達(dá)和純化的標(biāo)簽，建立目標(biāo)蛋白表達(dá)與純化的高效、廉價(jià)方 法。但是，由于天然的硫橫菌磨茹凝集素基因較長(zhǎng)，完整的基因有900多個(gè)核巧酸，翻譯成 約300個(gè)氨基酸，不適于用作融合蛋白標(biāo)簽進(jìn)行目標(biāo)蛋白的高效表達(dá)。現(xiàn)有的研究表明，天 然硫橫菌磨茹凝集素與乳糖結(jié)合的功能域主要位于N端的第1-187為氨基酸，因此，本申請(qǐng) 只表達(dá)硫橫菌磨茹凝集素N端的第1-187個(gè)氨基酸組成的區(qū)域（簡(jiǎn)稱為硫橫菌磨茹凝集素 N-乙酷氨基乳糖結(jié)合域）作為蛋白表達(dá)和純化的標(biāo)簽，建立目標(biāo)蛋白高效表達(dá)與純化的方 法。該硫橫菌磨茹凝集素N-乙酷氨基乳糖結(jié)合域的氨基酸序列為SEQIDNO. 2所示的氨 基酸序列，大小為21. 3kDa，編碼該區(qū)域的基因的核巧酸序列為SEQIDNO. 3所示的核巧酸 序列，長(zhǎng)度為56化P。
[0005] 此外，由于每種生物在對(duì)基因進(jìn)行翻譯時(shí)對(duì)密碼子的利用率有較大差異，運(yùn)種差 異直接影響基因表達(dá)的水平。而磨茹凝集素作為一種真菌蛋白，其密碼子在大腸桿菌中的 利用率較低，將直接導(dǎo)致后續(xù)的標(biāo)簽蛋白和目的蛋白的表達(dá)量較低，而且容易導(dǎo)致表達(dá)的 蛋白不可溶。為了解決運(yùn)個(gè)問題，本發(fā)明根據(jù)大腸桿菌密碼子嗜好性，對(duì)天然的硫橫菌磨茹 凝集素N-乙酷氨基乳糖結(jié)合域的基因序列進(jìn)行優(yōu)化，使其密碼子在大腸桿菌中具有高利 用率，使得硫橫菌磨茹凝集素N-乙酷氨基乳糖胺結(jié)合域可在大腸桿菌中高水平、可溶性表 達(dá)，從而提供一種W硫橫菌磨茹凝集素N-乙酷氨基乳糖胺結(jié)合域作為融合標(biāo)簽的目標(biāo)蛋 白表達(dá)與純化方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種人工優(yōu)化合成的能夠編碼 硫橫菌磨茹凝集素N-乙酷氨基乳糖胺結(jié)合域的L化基因；本發(fā)明的另一目的是提供含有上 述人工合成的LSL基因的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞；本發(fā)明的再一目的是提供一種W硫橫菌磨 茹凝集素N-乙酷氨基乳糖胺結(jié)合域作為融合標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白表達(dá)與純化的方法。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0008] 本發(fā)明首先提供了一種編碼硫橫菌磨茹凝集素N-乙酷氨基乳糖胺結(jié)合域的LSL 基因，所述L化基因的核巧酸序列為SEQIDNO. 1所示，所述L化基因編碼的蛋白的氨基酸 序列如沈QIDNO. 2所示。
[0009] 本發(fā)明還提供了一種包含所述的L化基因的表達(dá)載體。
[0010] 優(yōu)選地，上述的包含L化基因的表達(dá)載體為祀T28a-LSL所述表達(dá)載體 祀T28a-L化是W祀T28a(+)為起始質(zhì)粒載體構(gòu)建的，所述表達(dá)載體祀T28a-L化還包括化O I限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)、化nI限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)、BamHI限制性核酸內(nèi)切 酶識(shí)別位點(diǎn)和蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)。
[0011] 進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞為包含上述的L化基因 (其核巧酸序列為SEQIDNO. 1所示）的宿主細(xì)胞，或者為包含上述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種利用上述L化基因編碼合成的硫橫菌磨茹凝集素N-乙酷氨 基乳糖胺結(jié)合域作為融合標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白表達(dá)與純化方法，包括W下步驟：
[0013] (1)標(biāo)簽基因的構(gòu)建：
[0014] 人工合成編碼硫橫菌磨茹凝集素N-乙酷氨基乳糖胺結(jié)合域的L化基因，所述LSL 基因的核巧酸序列如SEQIDNO. 1所示，然后在L化基因的5'端加上限制性核酸內(nèi)切酶1 的識(shí)別位點(diǎn)，在其3'端依次加上限制性核酸內(nèi)切酶2的識(shí)別位點(diǎn)、蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)和限制 性核酸內(nèi)切酶3的識(shí)別位點(diǎn)，形成標(biāo)簽基因；
[0015] (2)表達(dá)載體1的構(gòu)建：
[0016] 用限制性核酸內(nèi)切酶1和3對(duì)標(biāo)簽基因進(jìn)行雙酶切處理，然后將雙酶切后回收得 到的含有L化基因的基因片段用DNA連接酶與經(jīng)過同樣雙酶切處理的大腸桿菌表達(dá)載體進(jìn) 行連接，得到含有L化基因片段的表達(dá)載體1;
[0017] (3)表達(dá)載體2和表達(dá)載體3的構(gòu)建：
[0018]a.目標(biāo)蛋白基因序列的合成：參照目標(biāo)蛋白的基因序列，人工合成目標(biāo)蛋白基 因，并在目標(biāo)蛋白基因的5'端加上限制性核酸內(nèi)切酶3的識(shí)別位點(diǎn)，在其3'端加上限制性 核酸內(nèi)切酶4的識(shí)別位點(diǎn)；
[0019]b.用限制性核酸內(nèi)切酶3和4分別對(duì)合成的目標(biāo)蛋白基因序列、表達(dá)載體1進(jìn)行 雙酶切處理，然后用DNA連接酶將雙酶切后回收得到的目標(biāo)蛋白基因序列和表達(dá)載體1進(jìn) 行連接，得到包含L化基因和目標(biāo)蛋白基因的表達(dá)載體2;
[0020] C.蛋白酶基因序列的合成：參照蛋白酶的基因序列，人工合成蛋白酶基因，并在 蛋白酶基因的5'端加上限制性核酸內(nèi)切酶2的識(shí)別位點(diǎn)，在其3'端加上限制性核酸內(nèi)切 酶3的識(shí)別位點(diǎn)，其中，所述蛋白酶為與步驟（1)中蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)相匹配的蛋白酶；
[0021] d.用限制性核酸內(nèi)切酶2和3分別對(duì)合成的蛋白酶基因序列、表達(dá)載體1進(jìn)行雙 酶切處理，然后用DNA連接酶將雙酶切后回收得到的蛋白酶基因序列和表達(dá)載體1進(jìn)行連 接，得到包含L化基因和蛋白酶基因的表達(dá)載體3;
[0022] (4)融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)：
[0023]a.將表達(dá)載體2和3分別轉(zhuǎn)化至宿主菌中，然后進(jìn)行鑒定，挑選出含有表達(dá)載體2 的陽性克隆菌和含有表達(dá)載體3的陽性克隆菌，分別進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，并加入IPTG誘導(dǎo)重組 蛋白的表達(dá)，所述IPTG的濃度為0. 2-1.Ommol/L;
[0024]b.發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，將兩種發(fā)酵產(chǎn)物分別進(jìn)行離屯、處理，各自收集菌體沉淀；然 后分別用細(xì)菌裂解液重懸菌體，超聲破碎菌體，離屯、并收集上清，分別得到表達(dá)產(chǎn)物2和表 達(dá)產(chǎn)物3
[00巧](5)融合蛋白的分離純化：
[0026]a.融合蛋白2的分離純化：將表達(dá)產(chǎn)物2上樣至凝膠過濾層析柱上，靜置 3-lOmin，然后打開凝膠過濾層析柱的下水口，控制流速為