甜瓜壞死斑點病毒侵染性克隆載體及其構(gòu)建方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程領域，是一種甜瓜病毒-甜瓜壞死斑點病毒侵染性克隆載體及其構(gòu)建方法。
【背景技術】
[0002]MNSV屬于香石竹斑駁病毒屬(CamKir# 6.)，病毒粒體為球形，直徑約30nm，基因組為正義單鏈RNA約4.3Kb，5'端不含帽子結(jié)構(gòu)且3'端不含poly (A)結(jié)構(gòu)，編碼5個開放閱讀框。它主要通過種子、土壤真菌和黃瓜黑頭葉甲進行自然傳播，另外還可以通過機械摩擦接種進行傳播。其寄主范圍僅限于葫蘆科的一些植物，例如西瓜、南瓜、葫蘆、黃瓜和甜瓜等，其中在甜瓜上是系統(tǒng)侵染。在甜瓜上引起的癥狀有:葉片，葉柄和莖干上出現(xiàn)壞死斑或者褪綠斑，植株矮化，使果實變小，嚴重影響作物的品質(zhì)和產(chǎn)量，隨著種子產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，該病害隨種子調(diào)運遠距離傳播將會嚴重影響我國甜瓜生產(chǎn)。
[0003]利用基因工程進行交叉保護，首先就要獲得病毒的全長基因進而構(gòu)建病毒侵染性的cDNA克隆，利用突變、缺失、插入、置換及互補試驗等逆向遺傳學分析手段對基因進行改造，獲得具有弱毒性的突變體。所謂病毒侵染性的cDNA克隆是指RNA病毒具有侵染性的cDNA或是cDNA具有侵染性的體外轉(zhuǎn)錄物。RNA病毒侵染性克隆的建立，使重組DNA技術及其它相關技術在研究中的應用成為可能，從而克服了 RNA病毒難以進行遺傳操作的問題。瓜類病毒病的防治目前缺乏有效的方法，可以通過轉(zhuǎn)基因抗病毒和弱毒株保護來實現(xiàn)。自然界弱毒株的發(fā)現(xiàn)極其困難和盲目。MNSV基因組很小，只有4.3kb，是非常好的基因工程材料。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的就在于克服現(xiàn)有技術的缺陷提供一種甜瓜壞死斑點病毒的侵染性克隆載體及其構(gòu)建方法。
[0005]本發(fā)明的目的是以下述技術方案實現(xiàn)的:
一種甜瓜壞死斑點病毒侵染性克隆載體，它是由甜瓜壞死斑點病毒全基因組與帶35S啟動子和核酶Rz的植物表達載體pCB301-2x35S-MCS-HDVRZ-N0S重組獲得甜瓜壞死斑點病毒侵染性克隆載體PCB301-MNSV。
[0006]如上所述的甜瓜壞死斑點病毒侵染性克隆載體的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟:
1)獲取甜瓜壞死斑點病毒RNA；
2)甜瓜壞死斑點病毒cDNA第一鏈的合成；
3)采用RT-PCR的方法分兩段擴增獲得甜瓜壞死斑點病毒全基因組，擴增甜瓜壞死斑點病毒基因的重組引物為:F1:5 , -AGG AAG TTC ATT TCA TTT GGA GAG G GGA TTA CTCTAG CCG GAT CCC CGA CTC-3 ' ；R1:5 ; -GAG TTC GCA TTG AAA CCC GAA TTG-3 ; ； F2:5 ' -AGC CGA CAT GGT AAG GCA CTG GAG A-3 ; ； R2:5 ; -AGG TGG AGA TGC CAT GCCGAC CC GGG CGG GAT GGG CCT ACA ACCC ATC TCA-3丨;甜瓜壞死斑點病毒基因的5丨和3 '端分別重組了 25bp和23bp的載體序列，引物序列劃線部分為與載體融合部分，F(xiàn)1/R1擴增1960bp的片段，F(xiàn)2/R2擴增2347bp的片段；
4)采用同源重組的方式將2個擴增片段與植物表達載體pCB301-2x35S-MCS-HDVRZ-N0S重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，篩選并提取獲得含有甜瓜壞死斑點病毒的全長基因的載體PCB301-MNSV。
[0007]步驟2)中病毒特異性 3'引物為:5, -GGG CGG GAT GGG CCT ACA ACCC ATCTCA-3 '。
[0008]步驟4)中植物表達載體pCB301-2x35S-MCS-HDVRZ-N0S經(jīng)5Y#和Sas雙酶切后與F1/R1和F2/R2擴增的甜瓜壞死斑點病毒的2個片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，涂布在含有kan抗生素的平板上，篩選含有甜瓜壞死斑點病毒的全基因組的克隆，用堿裂解法提取含有甜瓜壞死斑點病毒全長基因的克隆，獲得甜瓜壞死斑點病毒侵染性克隆載體PCB301-MNSV。
[0009]一種農(nóng)桿菌，它是通過采用凍融法將甜瓜壞死斑點病毒侵染性克隆載體PCB301-MNSV轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞制備得到的。
[0010]上述農(nóng)桿菌它通過注射法接種甜瓜幼苗檢測PCB301-MNSV的侵染性。
[0011]本發(fā)明采用同源重組的方式分兩段將擴增的甜瓜壞死斑點病毒(MNSV)基因片段與帶35S啟動子和核酶Rz的植物表達載體pCB301-2x35S-MCS-HDVRZ-N0S重組連接。與傳統(tǒng)的酶切連接相比，該方法既節(jié)省了工序，又提高了重組的陽性率。該方法的另外一個突出的優(yōu)點是不受限制性內(nèi)切酶有無的影響，不用考慮MNSV全長基因中是否含有載體上的限制性內(nèi)切酶，避免了實驗的繁瑣及內(nèi)切酶的限制。如果利用限制性內(nèi)切酶的酶切方法，該載體則不能使用，因為MNSV基因序列中含有3個內(nèi)切酶5kg，而載體的多克隆位點的內(nèi)切酶位點受限不能滿足克隆的需求。采用本發(fā)明的侵染性克隆載體在農(nóng)桿菌中大量表達，能侵染甜瓜，西瓜和黃瓜等葫蘆科作物，不侵染煙草，不感染動物和人類，相對安全，侵染性克隆的成功使對該病毒的研究易于在DNA水平上進行操作。
【附圖說明】
[0012]圖 1 是 pCB301-2x35S-MCS-HDVRZ-N0S 的載體圖；
圖2是甜瓜壞死斑點病毒侵染性克隆載體圖；
圖3是接種MNSV侵染性載體7天后甜瓜癥狀圖；
圖4是接種MNSV侵染性載體7天后甜瓜癥狀圖；
圖5是RT-PCR檢測MNSV侵染性克隆載體接種甜瓜后電泳圖。
【具體實施方式】
[0013]實施例1
一種甜瓜壞死斑點病毒侵染性克隆載體，如圖2所示，是通過將甜瓜壞死斑點病毒全基因組與帶35S啟動子和核酶Rz的植物表達載體pCB301-2x35S-MCS-HDVRZ-N0S重組獲得的。帶35S啟動子和核酶Rz的植物表達載體pCB301-2x35S-MCS-HDVRZ-N0S如圖1所示，已被公開(姚敏，張?zhí)炱?，田志超，王源超，陶小榮.農(nóng)桿菌介導的CMV侵染性克隆及2b缺失突變體構(gòu)建，中國農(nóng)業(yè)科學，2011，44(14):3060-3068);所述的甜瓜壞死斑點病毒全基因序列如SEQ ID N0:08所示。
[0014]上述甜瓜壞死斑點病毒侵染性克隆載體構(gòu)建方法包括以下步驟:
1、按常規(guī)方法從感染甜瓜壞死斑點病毒的發(fā)病株中抽提病毒粗體液，從病毒的粗體液中提取病毒的RNA:
1)病毒的粗體液制備
①取100g發(fā)病組織加入200ml的0.067M磷酸鈉緩沖液(ρΗ7.2)和50ml 0.1M的抗壞血酸，用勾楽機勾楽；15000g離心lOmin ;取上清，加0.1倍體積的氯仿，混勾；
②15000g離心lOmin，取上清；105，000g離心120min，去掉上清，留沉淀；
③用0.01M的磷酸鈉緩沖液(pH7.0)重新懸浮沉淀，為病毒的粗提液。
[0015]2)病毒RNA提取
取病毒的粗體液300 μ 1加入1ml TRIZOL plus (大連TaKaRa公司)，隨后根據(jù)TRIZ0Lplus試劑說明書方法提取病毒RNA。
[0016]2、以甜瓜壞死斑點病毒的全長基因信息為基礎，設計擴增麗SV的重組引物及通過RT-PCR的方法，擴增甜瓜壞死斑點病毒的全基因組
1)設計重組引物為:F1:5 ' -AGG AAG TTC ATT TCA TTT GGA GAG G GGA TTA CTCTAG CCG GAT CCC CGA CTC-3 ' (SEQ ID N0:02)；R1:5 ; -GAG TTC GCA TTG AAA CCC GAATTG-3 ' (SEQ ID NO:03); F2:5 ' -AGC CGA CAT GGT AAG GCA CTG GAG A-3 ' (SEQ IDN0:04) ； R2:5 , -AGG TGG AGA TGC CAT GCC GAC CC GGG CGG GAT GGG CCT ACA ACCCATC TCA-3 ; (SEQ ID N0:05)。在設計麗SV的擴增全長基因的引物時利用了重組融合的方法，劃線部分為與載體融合片段；麗SV基因的5 '和3'端分別重組了 25bp和23bp的載體序列，在麗SV的2個片段中間重組了約50bp。
[0017]2)通過RT-PCR的方法，擴增甜瓜壞死斑點病毒的全基因組，分為兩個片段擴增，F(xiàn)1/R1擴增出1960bp的片段，F(xiàn)2/R2擴增出2347bp的片段，中間重疊部分約為50bp ;把擴增的目的片段回收，保存?zhèn)溆?；具體步驟為:
①cDNA第一鏈的合成
反應程序參照M-MLV說明書，采用10 μ L反應體系如下:3 μ L總RNA，1 μ L病毒特異性3 '引物(5 ' -GGG CGG GAT GGG CCT ACA ACCC ATC TCA-3 '，SEQ ID N0:02) (10 μΜ)，70°C 變性 5min，迅速置冰上 3min ;再加入 2 yL 5 X React1n buffer，2 μ LdNTPs (2.5mMeach)，0.3 μ 1 RNase Inhibitor (40M/μ L)0.3 μ L 反轉(zhuǎn)錄酶(40M/ μ L)，最后加入 RNasefree H20補足10 μ L，42°C lh后，70°C 15min，置冰上待用，以上用到的各種試劑均購自大連TaKaRa公司。
[0018]②PCR擴增
采用20 μ 1RT-PCR擴增標準反應體系:2.0 μ L 10 X PCR buffer，2 yL正向和反向引物混合物(各10μΜ)，0.2 yLTaq DNA聚合酶(5 M/yL)，2 yL cDNA第一鏈合成產(chǎn)物和11.8 yLddH20。PCR反應循環(huán)參數(shù):94°C預變性5min ;94°C變性40 s，62°C退火40s，72°C延伸50s，循環(huán)30次；最后72°C 10 min。
[0019]3、與植物表達載體pCB301-2x35S-MCS-HDVRZ-N0S重組，獲得甜瓜壞死斑點病毒侵染性克隆PCB301-MNSV質(zhì)粒載體 l)pCB301-2x35S-MCS-HDVRZ-N0S用5?/和Sag雙酶切后經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，回收；限制性內(nèi)切酶均購自New England B1labs公司。
[0020]2)上述的擴增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，按照回收試劑盒(大連TaKaRa公司)說明書進行回收；回收的試劑置于_20°C備用。
[0021]3)利用同源重組酶(Clone