一種利用藻油制備富含ω-3脂肪酸磷脂的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]
本發(fā)明涉及一種利用藻油制備富含ω-3脂肪酸磷脂的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]磷脂(phospholipid, PL)是一類(lèi)具有疏水基團(tuán)和親水基團(tuán)的非極性物質(zhì)，主要是由磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酸(PS)、溶血磷脂(由PE、PC、PS、PI和PS脫去一個(gè)脂肪酸)等組成的混合物。根據(jù)磷脂的性質(zhì)與功能，磷脂可作為乳化劑、分散劑、抗氧化劑、潤(rùn)滑劑、營(yíng)養(yǎng)劑等而廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域。當(dāng)前世界每年生產(chǎn)乳化劑的產(chǎn)量達(dá)25萬(wàn)噸以上，其中磷脂占總量的20%左右。我國(guó)市售磷脂乳化劑主要來(lái)自大豆磷脂，存在產(chǎn)品種類(lèi)單一、缺乏必需脂肪酸、應(yīng)用產(chǎn)品窄等缺點(diǎn)，直接或間接影響了食品、醫(yī)藥、飼料等領(lǐng)域的發(fā)展。眾所周知，ω-3脂肪酸(如亞麻酸(ALA，18: 3η-3)、十八碳四烯酸(SDA, 18: 4η_3)、二十碳五烯酸(ΕΡΑ，20: 5η_3)和二十二碳六烯酸(DHA，22:6n-3)是人體的必需脂肪酸，它們具有促進(jìn)嬰幼兒生長(zhǎng)發(fā)育、增強(qiáng)人體免疫力、抗腫瘤、預(yù)防中風(fēng)和痛風(fēng)等方面的生物學(xué)功能。因此，開(kāi)發(fā)富含ω-3脂肪酸的磷脂作為乳化劑或添加劑應(yīng)用到食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域是當(dāng)前研發(fā)改性油脂領(lǐng)域的熱門(mén)方向之
O
[0003]當(dāng)前，生產(chǎn)富含ω-3脂肪酸磷脂的主要技術(shù)是化學(xué)催化法和酶催化法。ShijiHama等(Shiji Hama et al, 2015)指出化學(xué)催化法用于生產(chǎn)ω-3脂肪酸磷脂，具有反應(yīng)慢和消耗昂貴的催化劑，而且高溫下易導(dǎo)致油的氧化，進(jìn)而產(chǎn)生副產(chǎn)物、色變等現(xiàn)象。酶催化制備富含ω-3脂肪酸的功能性磷脂，可以克服化學(xué)催化法的缺點(diǎn)，具有高效、專一、反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物少、重復(fù)利用酶等優(yōu)點(diǎn)，將是當(dāng)前研發(fā)和今后應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的首選技術(shù)。歐美、日本、韓國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家在油脂改性及其工業(yè)化應(yīng)用的研究一直處于領(lǐng)先地位(Haraldsson and Thorarensen, 1998; Garcia et al, 2008;Marsaouri et al,2013;Zhao et al, 2014)。但這些發(fā)達(dá)國(guó)家的研究者主要利用大豆磷脂或磷脂酰膽堿和過(guò)量的高純度(高于78 %) ω-3脂肪酸或純的ω-3脂肪酸乙酯為原料，通過(guò)酶的酸解反應(yīng)或轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)將ω-3脂肪酸替換磷脂上的脂肪酸；優(yōu)化后，ω-3脂肪酸含量可達(dá)12.3%-57.4%。在中試或規(guī)?；缴希摲椒ㄊ遣豢尚械?，主要原因是原料中需要精制的ω-3脂肪酸成本過(guò)高。我國(guó)關(guān)于開(kāi)發(fā)富含ω-3脂肪酸的磷脂，暫處于起步階段。如，南方科技大學(xué)的Li等(Li et al, 2014)也是通過(guò)上述方法獲得ω-3脂肪酸含量為30.7 %的大豆磷脂酰膽堿。因此，研究開(kāi)發(fā)富含ω-3脂肪酸的功能性磷脂應(yīng)用到食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域，具有重要的意義。
[0004]富含ω-3脂肪酸的可食用油主要是魚(yú)油和海洋微藻藻油。近年來(lái)，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)消耗了全球83 %的魚(yú)油，人類(lèi)直接食用魚(yú)油僅占總量的6 %。2015年6月，F(xiàn)AO Globefish已公布了魚(yú)油的價(jià)格為2400 $/噸，比去年魚(yú)油價(jià)格高了 300$/噸。高價(jià)格的魚(yú)油直接制約了開(kāi)發(fā)富含ω-3脂肪酸的功能性油脂。富含ω-3脂肪酸的磷脂主要是蝦油、海魚(yú)魚(yú)油和海洋微藻藻油。磷脂是組成動(dòng)物組織細(xì)胞膜的重要成分，其含量較低。此外，基于海洋食物鏈角度分析，海魚(yú)富集ω-3脂肪酸主要來(lái)自富含ω-3脂肪酸的海洋微藻。近年來(lái)，歐盟國(guó)家已利用等鞭金藻、微綠球藻、螺旋藻等藻粉作為添加劑，以提高意大利面和餅干的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。大量文獻(xiàn)表明，微綠球藻具有生長(zhǎng)速度快，油脂含量高，富含ω-3脂肪酸，其中磷脂含量可達(dá) 30% (Ryckebosch et al, 2014; Yao et al, 2015)。因此，富含 ω-3 脂肪酸的藻油是用來(lái)開(kāi)發(fā)高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的功能性磷脂的最佳油源，可以克服當(dāng)前油源短缺問(wèn)題。
[0005]國(guó)內(nèi)外對(duì)開(kāi)發(fā)功能性磷脂還面臨如何篩選具有專一性強(qiáng)、催化效率高、綠色環(huán)保和富集高含量ω-3脂肪酸的脂肪酶。目前常用的商用脂肪酶有非選擇性的固定化脂肪酶(如，Novozyme 435，CALA等)、1，3選擇性的酶(如TL IM, RM IM,等)和磷脂酶PLA1。尋找具有水解磷脂的飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸的脂肪酶，是當(dāng)前開(kāi)發(fā)富含ω-3脂肪酶的功能性磷脂的難題。2011年，丹麥奧胡斯大學(xué)的Xuebing Xu教授研究CALA脂肪酶的生物印記發(fā)現(xiàn):在乙醇條件，該酶能水解油脂的8個(gè)碳鏈和油酸；但他們未進(jìn)一步利用該酶對(duì)其ω-3脂肪酸的選擇性進(jìn)行綜合分析。因此，本專利以富含ω-3脂肪酸的藻油磷脂為底物，從多種酶中篩選并研發(fā)出具有高效地富集ω-3脂肪酸的功能性磷脂。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的就是以富含ω-3脂肪酸的藻油為原料，利用綠色環(huán)保的的脂肪酶催化法制備富含ω-3脂肪酸的磷脂。
[0007]為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的而采用的技術(shù)方案和步驟是:
1、藻油提取。
[0008]稱取一定量的微藻藻粉，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60-100%乙醇作為萃取劑，利用加速溶劑萃取儀進(jìn)行萃取，萃取溫度為55?120 °C,萃取時(shí)間25?85 min，萃取次數(shù)為2?5次。萃取結(jié)束后將萃取液置于真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將有機(jī)溶解蒸發(fā)，蒸發(fā)后所得剩余物即為藻油。
[0009]本發(fā)明所述的微藻，是指裂殖壺藻、等鞭金藻、寇式隱甲藻、微綠球藻、綠色巴夫藻、布朗葡萄藻、三角褐指藻、菱形藻、小球藻、柵藻以及杜氏藻。
[0010]2、藻油磷脂的分離。
[0011]將上述獲得的藻油，以藻油:丙酮的體積比為1:10加入食品級(jí)丙酮，充分混勻，30min后，4000 rpm/min離心lOmin，所得沉淀物為藻油磷脂粗品。
[0012]本步驟重復(fù)三次。
[0013]3、磷脂酰膽堿的純化。利用硅膠色譜柱分離上述藻油磷脂粗品得到純化的磷脂酰膽堿。
[0014]I)用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%乙醇洗脫色譜柱分離去除含磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸。
[0015]2)用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%乙醇洗脫色譜柱分離獲得純度高于85%的磷脂酰膽堿。
[0016]4、富含ω-3脂肪酸的功能性溶血磷脂的合成。
[0017]將上述提取的藻油磷脂粗品或磷脂酰膽堿與乙醇混合，再加入脂肪酶和適量的水，利用脂肪酶醇解反應(yīng)制備得到富含ω-3脂肪酸的功能性溶血磷脂液。反應(yīng)條件為:藻油磷脂粗品或磷脂酰膽堿和乙醇的質(zhì)量比1:1?4、脂肪酶的加入量占藻油磷脂粗品或磷脂酰膽堿質(zhì)量的5?18%、加水量占藻油磷脂粗品或磷脂酰膽堿質(zhì)量的O?15 %、反應(yīng)溫度25?55 °C、反應(yīng)時(shí)間為6h?72h，攪拌速度500r/min。
[0018]所述的脂肪酶是指固定化脂肪酶A-CALA或游離脂肪酶A ;
所述的固定化脂肪酶A-CALA購(gòu)自美國(guó)CODEIX公司，游離脂肪酶A購(gòu)自丹麥諾維信公司。
[0019]5、富含ω-3脂肪酸的功能性溶血磷脂的提純。
[0020]將上述反應(yīng)產(chǎn)物功能性溶血磷脂液與食品級(jí)正己烷按1:9的體積比例混合提取3次，收集乙醇相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醇和水后獲得富含ω-3脂肪酸的功能性溶血磷脂。
[0021]采用本發(fā)明專利所述的工藝條件，以藻油磷脂粗品為合成原料時(shí)，酶催化反應(yīng)后溶血磷脂中ω-3脂肪酸的總含量可達(dá)40%以上。以磷脂酰膽堿為合成原料時(shí)，酶催化反應(yīng)后溶血磷脂中ω-3脂肪酸的總含量可達(dá)60%以上。
【具體實(shí)施方式】
[0022]實(shí)施例1
1、提取藻油。稱取1g微綠球藻藻粉，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%乙醇為萃取劑，利用加速溶劑萃取儀萃取，萃取條件為:溫度100°C、重復(fù)提取3次、處理時(shí)間35 min。萃取結(jié)束后萃取液置于真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將有機(jī)溶解蒸發(fā)，蒸發(fā)后所得剩余物即為藻油。
[0023]2、藻油磷脂的分離。將上述獲得的藻油，以藻油:丙酮為1:10加入食品級(jí)丙酮，充分混勾30min后，4000 rpm/min離心lOmin，所得沉淀物為藻油磷脂粗品。本步驟重復(fù)三次。
[0024]3、富含ω-3脂肪酸的功能性溶血磷脂的純化。利用上述提取的藻油磷脂粗品與乙醇混合，再加入固定化脂肪酶A-CALA和適量的水，利用脂肪酶醇解反應(yīng)制備富含ω-3脂肪酸的功能性溶血磷脂液，反應(yīng)條件為:藻油磷脂粗品和乙醇的質(zhì)量比1:3、反應(yīng)溫度450C、固定化脂肪酶A-CALA加量占藻油磷脂的質(zhì)量12%、含水量占藻油磷脂質(zhì)量的2%、反應(yīng)時(shí)間24h，攪拌速度500r/min。
[0025]4、富含ω-3脂肪酸的功能性溶血磷脂的提純。將上述反應(yīng)產(chǎn)物功能性溶血磷脂液與食品級(jí)正己烷按1:9的體積比例混合提取3次，收集乙醇相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醇和水后獲得富含ω-3脂肪酸的功能性溶血磷脂。
[0026]本實(shí)施例所述的固定化脂肪酶A-CALA購(gòu)自美國(guó)CODEIX公司。
[0027]采用本發(fā)明專利所述的工藝條件，酶催化反應(yīng)后溶血磷脂中ω-3脂肪酸的總含量達(dá)43 %。
[0028]