制備麥角硫因的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物資源、生物工程、發(fā)酵工程及天然產(chǎn)物的生物合成領(lǐng)域。更具體 地，本發(fā)明涉及一種W更高的產(chǎn)量制備麥角硫因的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 麥角硫因化-Ergothioneine,EGT)是一種稀有的天然手性氨基酸，作為生物體內(nèi) 重要的生理活性物質(zhì)，起著抗氧化，防止紫外福射損傷，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原反應(yīng)，莖合 二價(jià)金屬離子，參與細(xì)胞內(nèi)的能量調(diào)節(jié)等諸多生物學(xué)功能，是一種多功能的細(xì)胞生理保護(hù) 劑（劉埼，姜文俠，楊萍，周濤.麥角硫因一多功能的生理細(xì)胞保護(hù)劑[J].天然產(chǎn)物研究 與開發(fā)，2013, 25 (增刊）：160-164)。麥角硫因是通常認(rèn)為安全的（generallyreco即ized assafe,GRA巧產(chǎn)品，性能穩(wěn)定，在醫(yī)藥、生物醫(yī)學(xué)、食品、保健食品、食品添加劑和化妝品等 行業(yè)具有重要的應(yīng)用價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。
[0003] 由于目前麥角硫因的制備成本高，限制了其應(yīng)用。與化學(xué)合成法和天然生物提取 法相比，利用食用菌深層發(fā)酵制備麥角硫因，可W通過建立高強(qiáng)度發(fā)酵過程控制策略，提高 麥角硫因的積累量，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的高效生產(chǎn)，降低生產(chǎn)成本，而且具有產(chǎn)品安全等優(yōu)勢(shì)，是 合成麥角硫因的發(fā)展方向（劉埼，張維亞，姜文俠，梅保良，周濤.麥角硫因生物合成技術(shù)的 研究進(jìn)展[幻.2013年國際氨基酸產(chǎn)業(yè)發(fā)展高峰論壇論文集.2013 :22-27)。
[0004] 日本PramvadeeTepwong等利用香茹(Xentinulaedodes)菌絲體深層發(fā)酵制備麥 角硫因，發(fā)酵第15天時(shí)發(fā)酵液中麥角硫因的產(chǎn)量為23.6mg/L(PramvadeeTepwong,Anupam Giri,FumitoSasaki.Mycobialenhancementofergothioneinebysubmerged cultivationofediblemushroommyceliaanditsapplicationasanantioxidative compound[J] ?FoodQiemistry，2012, 131:247 - 258);韓國WiYoungLee等利用紫黑靈 芝（Ganodermaneo-japonicum)菌絲體發(fā)酵合成麥角硫因，發(fā)酵結(jié)束時(shí)發(fā)酵液中麥角硫 因白勺含量達(dá) 57. 5mg/L(WiYoungLee,Eung-JunPark,JinKwonAhn.Supplementationof methionineenhancedtheergothioneineaccumulationintheGanodermaneo-japonicum mycelia[J].ApplBiochemBiotechnol, 2009, 158:213-221);臺(tái)灣黃齡誼和QiiLh-Hung Liang對(duì)杏鮑茹巧Ieurotuseryngii)菌絲體進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后，發(fā)酵液 中麥角硫因的產(chǎn)量分別達(dá)62. 2mg/L(黃齡誼.高麥角硫因含量么杏鮑茹菌絲體深層培 養(yǎng)及其生理活性巧].臺(tái)灣：中興大學(xué)，2010)和60. 4mg/L(CMh-HungLiang，Ling-Yi Huang,Kung-JuiHo,etal.Submergedcultivationofmyceliumwithhighergothioneine contentfromtheculinary-medicinalkingoystermushroomPleurotuseryngii(higher basidiomycetes)anditscomposition[J].InternationalJournalofMedicinal Mushrooms, 2013, 15(2) :153-164);姜文俠等利用禮皮側(cè)耳巧Ieurotusostrea化s)菌絲 體發(fā)酵制備麥角硫因，通過對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵控制工藝的優(yōu)化，發(fā)酵液中麥角硫因的含 量達(dá)到135. 7mg/L(姜文俠，劉埼，周濤.生產(chǎn)麥角硫因的菌株及制備麥角硫因的方法[P]. CN201210392417.8)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是進(jìn)一步提高中國發(fā)明專利申請(qǐng)CN201210392417.8中麥角硫因的 發(fā)酵產(chǎn)量，提供一種改進(jìn)的制備麥角硫因的方法。將中國發(fā)明專利申請(qǐng)CN201210392417.8 的全部內(nèi)容引入本文W供參考。
[0006] 在中國發(fā)明專利申請(qǐng)CN201210392417.8中，公開了一種制備麥角硫因的方法，包 括如下步驟：
[0007] 1)將糖皮側(cè)耳CGMCCNo. 6232的固體菌種（優(yōu)選PDA斜面菌種）接種至液體種子 培養(yǎng)基，在19~3TC搖床100~20化pm培養(yǎng)至少3天，制備種子液；
[0008] 2)將種子液按4~20%的接種量（V/V)接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，然后在19~3rC搖 床100~20化pm培養(yǎng)至少6天，得到糖皮側(cè)耳菌絲體發(fā)酵液；
[0009]3)發(fā)酵結(jié)束后，將菌絲體發(fā)酵液升溫至50~IOOC，W 0~60化pm攬拌浸提10~ lOOmin，麥角硫因從菌絲體的細(xì)胞內(nèi)浸提到細(xì)胞外的發(fā)酵液中。
[0010] 所述的液體種子培養(yǎng)基的組成為；玉米粉15~50g/L(優(yōu)選25~40g/L)、豆巧粉 10~35g/L(優(yōu)選15~25g/L)、a-淀粉酶20~80U/L(優(yōu)選30~65U/L)、磯酸二氨鐘 1~6g/L(優(yōu)選2~4. 5g/L)、硫酸鎮(zhèn)0. 2~5g/L(優(yōu)選0. 2~3g/L)，其余為水。
[0011] 所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：甘油10~80旨/1，酪蛋白腺10~40g/l，磯酸二氨鐘 2~4g/l，硫酸鎮(zhèn)0. 5~2g/l，其余為水。
[0012] 本發(fā)明的巧術(shù)方案
[0013] 根據(jù)本發(fā)明，使用糖皮側(cè)耳（PleurotusostreaUis)TIB.BPE. 10010,作為發(fā)酵菌 種發(fā)酵制備麥角硫因。該菌種已于2012年6月15日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普 通微生物中必（簡稱CGMCC)保藏，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 6232。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步提高麥角硫因發(fā)酵產(chǎn)量的制備方法包括如下步驟：
[0015] (a)將糖皮側(cè)耳CGMCCNo. 6232的菌種接種至種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)制備種子液，其中 所述種子培養(yǎng)基使用豆餅粉作為氮源；和
[0016] (b)將種子液接種至發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基，然后培養(yǎng)得到糖皮側(cè)耳菌絲體發(fā)酵液。
[0017] 優(yōu)選地，糖皮側(cè)耳CGMCCNo. 6232獲自PDA斜面培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基為；玉米粉 15~50g/L(優(yōu)選25~40g/L)、豆餅粉5~35g/L(優(yōu)選15~35g/L)、a-淀粉酶20~ 80U/L(優(yōu)選30~65U/L)、磯酸二氨鐘1~6g/L(優(yōu)選2~4. 5g/L)、硫酸鎮(zhèn)0. 2~5g/L(優(yōu) 選0. 2~3g/L)，其余為水；發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基為；甘油10~95g/L、酪蛋白腺10~80g/L、磯 酸二氨鐘2~4g/L、硫酸鎮(zhèn)0. 5~2g/l，其余為水。
[0018] 優(yōu)選地，步驟（a)中的培養(yǎng)操作在19~3rC進(jìn)行至少3天，步驟化）中的培養(yǎng)操 作在19~3rc進(jìn)行至少6天，且步驟化）中的接種量為4~20 (V/V) %。
[0019] 進(jìn)一步，向發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加W下的任一種或多種物質(zhì)：NH4CI、NH4NO3、葉酸、 維生素Bl(VBl)、剛巧了酸、巧樣酸、丙麗酸、谷氨酸、天冬氨酸、甜菜堿、組氨酸、半脫氨酸、 蛋氨酸、吐溫（tween,例如吐溫60和吐溫80)和司盤（span,例如司盤80)。該添加步驟可 W在發(fā)酵前或發(fā)酵的過程中進(jìn)行。
[0020] 優(yōu)選地，向發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加W下量的任一種或多種物質(zhì)；NH4CIO. 5g/L~ 12g/L、NH4NO3O. 5g/L~lOg/L、葉酸 0. 08g/L~2. 56g/L、VBlO.Olg/L~0.8g/L、剛巧了酸 0.Img/L~4mg/L、巧樣酸 0.Olg/L~0.8g/L、丙麗酸 0. 05g/L~4. 5g/L、谷氨酸IJimol/L~100ymol/L、天冬氨酸 0. 05g/L~9g/L、甜菜堿 50mmol/L~250mmol/L、組氨酸 0.Immol/L~3mmol/L、半脫氨酸 2mmol/L~45mmol/L、蛋氨酸 3mmol/L~45mmol/L、吐溫 0. 5g/L~50g/L(例如吐溫 602g/L~50g/L、吐溫 800. 5g/L~40g/L)和司盤 0. 2g/L~ lOg/L(例如司盤 800. 2g/L~lOg/L)。
[0021] 本發(fā)明的巧術(shù)效果
[0022] 使用豆餅粉作為糖皮側(cè)耳CGMCCNo. 6232發(fā)酵合成麥角硫因的種子培養(yǎng)基的 氮源，適當(dāng)提高發(fā)酵培養(yǎng)基中甘油和酪蛋白腺的含量，向發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加NH4CI、 NH4NO3、葉酸、維生素Bl(VBl)、剛巧了酸、巧樣酸、丙麗酸、谷氨酸、天冬氨酸、甜菜堿、組氨 酸、半脫氨酸、蛋氨酸、吐溫和司盤中的任意一種或多種化合物，可顯著提高麥角硫因的發(fā) 酵水平，產(chǎn)物的產(chǎn)率比對(duì)照組大幅度提高。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 本發(fā)明的W下實(shí)施例僅用來說明實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】，送些實(shí)施方式不能 理解為是對(duì)本發(fā)明的限制。其它的任何在未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、 修飾、替代、組合、簡化，均視為等效的置換方式，落在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0024] 實(shí)驗(yàn)儀器、材料：搖床（IS-RDV3,美國精琪有限公司）；高效液相色譜儀 (Agilentl260,AgilentTechnologies);水浴鍋（TW20,Jul油O公司）；數(shù)字式加熱磁力攬 拌器（MIXControl20,WIGGENS公司）；電子分析天平（AB204-S，METTLERTOLEDO);活塞式 真空泉（V610,化emVak);超聲波清洗機(jī)（SB-5200D型，寧波新芝生物科技股份有限公司）； 0.22um孔徑微孔濾膜（天津博納艾杰爾科技有限公司）；中空纖維超濾膜（天津愛生膜過 濾技術(shù)有限公司）。
[00巧]主要試劑：麥角硫因?qū)φ掌罚兌?gt;98%，BiomolInternationalInc.) ;PDA培養(yǎng) 基度ecton，DickinsonandCompany);甲醇等試劑為市售色譜純；磯酸二氨鐘、硫酸鎮(zhèn)、巧 樣酸購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；玉米粉購自梅河口市興達(dá)米業(yè)有限責(zé)任公司；豆餅 粉和豆巧粉購自北京中棉紫光生物科技有限公司；甘油購自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限 公司；酪蛋白腺購自偃師市百家工貿(mào)有限公司；NH4CLNH4NO3、丙麗酸和司盤80購自天津市 光復(fù)精細(xì)化工有