顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞微切割和回收的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種細(xì)胞樣本采集領(lǐng)域，特別設(shè)及在普通顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞微切割和 回收的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 在生命科學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，需要對(duì)組織中某一特定的細(xì)胞群體進(jìn)行基因或蛋白質(zhì)的研 究。例如，人體腫瘤千差萬別，即使是同一個(gè)部位的腫瘤，治療效果和方法也應(yīng)因人而異。隨 著基因分子水平研究的不斷深入，越來越多的腫瘤細(xì)胞信號(hào)通路被發(fā)現(xiàn)，大量臨床研究表 明，通路中特定基因的擴(kuò)增/突變/表達(dá)狀態(tài)與祀向、化療藥物有效性密切相關(guān)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，化 療總體有效率在30%到40%，而通過基因檢測(cè)篩選出獲益病人，有效率可W提高到80%。 因此利用基因檢測(cè)能最大程度地提高治療的效率，減少藥物的毒副作用，避免用藥不當(dāng)貽 誤治療時(shí)機(jī)。美國抑A已經(jīng)強(qiáng)制要求用藥前進(jìn)行EGFR、KRAS等基因檢測(cè)。美國國家綜合癌 癥網(wǎng)絡(luò)已經(jīng)將EGFR、KRAS、ERCC1、RRM1、肥R2等基因檢測(cè)納入到癌癥治療指南中?，F(xiàn)在腫 瘤基因檢測(cè)主要針對(duì)一些實(shí)體瘤，如肺癌、腸癌、乳腺癌、胃癌等。
[0003] 在分析過程中，首先需要從生物體中獲得待測(cè)組織樣本。在通常情況下，待測(cè)組織 樣本中特定細(xì)胞的量是充足的。然而有時(shí)臨床樣本的量不能滿足檢測(cè)要求。例如在腫瘤分 子診斷中，需要分析組織中腫瘤細(xì)胞的基因情況，但若組織樣本中的腫瘤細(xì)胞量非常少，而 其他細(xì)胞或細(xì)胞間質(zhì)比例很高時(shí)，提取獲得的腫瘤DNA的量不能滿足基因檢測(cè)的要求，造 成假陰性的檢測(cè)結(jié)果。因此需要從多樣性的組織中進(jìn)一步分離出形態(tài)單一的細(xì)胞群，提高 待分析樣本中特定細(xì)胞群（例如腫瘤細(xì)胞）的占比，使基因或蛋白分析更加準(zhǔn)確。
[0004] 利用激光微切割儀器分離腫瘤組織切片中的腫瘤細(xì)胞是目前常用的方法。激光 微切割具有切割效果好，收集效率高和對(duì)后續(xù)基因、蛋白檢測(cè)影響小的特點(diǎn)，但激光微切割 成本高，耗時(shí)長。人工對(duì)腫瘤組織切片中的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行顯微鏡下的鏡檢和切割也是目前 常用的切割方法。該方法成本低，對(duì)設(shè)備的要求不高。但是，一方面因切割下的細(xì)胞非常微 小，肉眼幾乎不能觀察到，細(xì)小的細(xì)胞離開顯微鏡后不能被肉眼看到。另一方面腫瘤細(xì)胞 在組織切片中所占比例非常低，運(yùn)些因素讓顯微鏡下切割后的細(xì)胞的成功轉(zhuǎn)移變得非常困 難。如何實(shí)現(xiàn)將切割下來的細(xì)胞準(zhǔn)確轉(zhuǎn)移成為人工顯微鏡下鏡檢切割和富集目標(biāo)細(xì)胞的一 個(gè)瓶頸，是當(dāng)前急需解決的技術(shù)問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題，本發(fā)明提供了一種顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞微切割和回收 的方法，包括W下步驟：
[0006] (1)組織切片的制備；
[0007] 似將（1)中所述組織切片放在顯微鏡下，確定切割區(qū)域；
[0008] (3)在顯微鏡下進(jìn)行腫瘤細(xì)胞切割；
[0009] (4)細(xì)胞轉(zhuǎn)移和收集：將細(xì)胞轉(zhuǎn)移膜粘貼于經(jīng)（3)切割的切片上，所述細(xì)胞轉(zhuǎn)移膜 粘附了切割下來的腫瘤細(xì)胞后，將所述細(xì)胞轉(zhuǎn)移膜放入細(xì)胞收集器中，腫瘤細(xì)胞與轉(zhuǎn)移膜 分離，獲得經(jīng)顯微切割獲得的腫瘤細(xì)胞。
[0010] 進(jìn)一步地，步驟（2)中，在4倍物鏡下確定腫瘤細(xì)胞的切割區(qū)域。
[0011] 進(jìn)一步地，步驟（3)中，將物鏡調(diào)至10倍，并在該倍數(shù)下利用切割工具進(jìn)行顯微切 害d，切割出腫瘤細(xì)胞。
[0012] 進(jìn)一步地，所述切割工具選自注射器、刀片之一。
[0013] 進(jìn)一步地，將注射器推桿拉至最大距離，用手W握筆方式手持注射器，在顯微鏡觀 察下讓注射器針頭接近切片中腫瘤細(xì)胞區(qū)域，持注射器的手控制針頭來回移動(dòng)切割目標(biāo)區(qū) 域腫瘤細(xì)胞。
[0014] 進(jìn)一步地，所述細(xì)胞轉(zhuǎn)移膜是由能被消化酶消化的材料制成。
[0015] 進(jìn)一步地，經(jīng)消化酶消化，轉(zhuǎn)移膜被消化酶消化，腫瘤細(xì)胞與轉(zhuǎn)移膜分離。
[0016] 本發(fā)明的有益效果是：當(dāng)樣本中腫瘤細(xì)胞占比較少時(shí)，利用本發(fā)明所述方法，能夠 在普通顯微鏡下回收和富集樣本中的腫瘤細(xì)胞，滿足分子診斷需要的細(xì)胞用量。解決了在 顯微鏡下切割得到的細(xì)胞不能被肉眼看到和準(zhǔn)確轉(zhuǎn)移的技術(shù)問題，且操作方法簡單、成本 低。
【附圖說明】
[0017] 圖1在顯微鏡下確定需要切割的區(qū)域；
[0018] 圖2使用注射器在顯微鏡下切割腫瘤細(xì)胞。
[0019] 圖3是切割前的細(xì)胞切片。
[0020] 圖4是切割并還剩有未轉(zhuǎn)移的細(xì)胞切片。
[0021] 圖5是腫瘤細(xì)胞被完全切割和轉(zhuǎn)移后的細(xì)胞切片。
[0022] 圖6是使用本發(fā)明所述方法獲得的樣本Sanger測(cè)序結(jié)果圖。
[0023] 圖7未使用本發(fā)明所述方法獲得的樣本Sanger測(cè)序結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明。運(yùn)些具體的實(shí)施例僅僅是在不違 背本發(fā)明精神下的有限列舉，并不排除本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員把現(xiàn)有技術(shù)和本發(fā)明結(jié)合而 產(chǎn)生的其他具體的實(shí)施方案。
[0025] (一）用于顯微切割的樣本采集
[00%] 根據(jù)病例情況，獲得需要顯微切割的組織樣本。
[0027] (二）操作工具：切割裝置；細(xì)胞收集器；細(xì)胞轉(zhuǎn)移膜；綴子、剪刀、橡膠手套、記號(hào) 筆等。
[0028] 所述切割裝置選自注射器、切割刀片等。所述細(xì)胞收集器選自1. 5ml或2ml的干 燥EP管等。優(yōu)選的方案中，所述細(xì)胞轉(zhuǎn)移膜具有一定的粘性，可W粘附住細(xì)胞，在優(yōu)選方案 中，轉(zhuǎn)移膜可W被消化酶消化的材料制成，例如封口膜（parafilim)等。
[0029] (S)顯微鏡下切割和回收細(xì)胞的操作步驟
[0030] 3. 1組織切片的制備：病理醫(yī)生確認(rèn)需進(jìn)行微切割的病例，根據(jù)鏡下所見評(píng)估所 需切面數(shù)，進(jìn)行切片、染色，不封片。
[0031] 3. 2確定切割區(qū)域：將擬切割切片放置于顯微鏡載物盤，在物鏡下確定切割區(qū)域。 優(yōu)選的方案中，在4倍物鏡下確定腫瘤細(xì)胞的切割區(qū)域。
[0032] 3. 3腫瘤細(xì)胞切割：在顯微鏡觀察下用切割裝置切割出目標(biāo)區(qū)域的腫瘤細(xì)胞。優(yōu) 選的方案中，將物鏡調(diào)整至10倍，并在該倍數(shù)下利用切割工具切割出目標(biāo)區(qū)域的腫瘤細(xì) 胞。
[0033] 3. 4細(xì)胞轉(zhuǎn)移和收集
[0034] 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移膜粘貼于切片上，使切割下的腫瘤細(xì)胞能粘附于細(xì)胞轉(zhuǎn)移膜上，輕輕 取下粘附著細(xì)胞的轉(zhuǎn)移膜，并將所述細(xì)胞轉(zhuǎn)移膜放入細(xì)胞收集器中。被轉(zhuǎn)移的細(xì)胞與轉(zhuǎn)移 膜分離，獲得經(jīng)顯微切割獲得的腫瘤細(xì)胞。
[0035] 所述細(xì)胞與轉(zhuǎn)移膜的分離方法，包括利用洗脫液將細(xì)胞從轉(zhuǎn)移膜上洗脫下來，或 利用消化過程，消化轉(zhuǎn)移膜，留下目標(biāo)產(chǎn)物。
[0036] 在消化轉(zhuǎn)移膜的方法中，所述的細(xì)胞轉(zhuǎn)移膜是由可W被消化的材料制成。在一個(gè) 優(yōu)選的方案中所述細(xì)胞轉(zhuǎn)移膜可W被消化酶消化，所述消化酶選自蛋白酶K等。具體的，向 細(xì)胞收集器中加入消化酶，消化酶將細(xì)胞轉(zhuǎn)移膜溶解，獲得切割下來的腫瘤細(xì)胞。
[0037] 切割完成后將切割裝置上粘附的腫瘤細(xì)胞注入細(xì)胞收集器中，可W再顯微鏡下重 復(fù)操作多次，W盡可能多的收集經(jīng)顯微切割下來的腫瘤細(xì)胞。
[0038] 在利用細(xì)胞轉(zhuǎn)移膜轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞前，操作者可W緩慢、平穩(wěn)的從顯微鏡上取下已 切割