一種白術(shù)根腐病菌檢測用引物及快速檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種白術(shù)根腐病菌檢測用引物及快速檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 白術(shù)（Atractylodesmacrocephala)屬于菊科、蒼術(shù)屬多年生草本植物，主要分布 于湖北、四川、云南、貴州、浙江等山區(qū)濕地。以根莖入藥，有健脾益氣，燥濕利水，止汗，安胎 的功效，是參苓白術(shù)丸、八珍膏、參桂鹿茸丸和香砂養(yǎng)胃丸等中成藥的重要原料藥，屬大宗 藥材。You等2013年在《PlantDisease》報(bào)道由角擔(dān)菌（Ceratobasidium.sp)引起的白 術(shù)的根腐病是全國白術(shù)種植中最大的問題，該菌通過土壤和種苗帶菌進(jìn)行傳染，許多種植 田塊發(fā)病率高達(dá)70%，有的整田甚至絕收。白術(shù)根腐病的發(fā)生和蔓延嚴(yán)重影響白術(shù)相關(guān)產(chǎn) 業(yè)的發(fā)展和壯大。傳統(tǒng)病原菌的鑒定必須在植株表現(xiàn)出癥狀后才可以實(shí)施，需要病原菌分 離、純化培養(yǎng)、科赫氏法則驗(yàn)證、形態(tài)學(xué)觀察、生理生化性狀等去鑒定，順利的話完成整個過 程需要大約10-20天，但是一旦產(chǎn)生其他雜菌污染培養(yǎng)基，就會影響鑒別速度，同時長時間 的鑒定耽誤防治時機(jī)。傳統(tǒng)鑒定存在的鑒定不準(zhǔn)、耗時、費(fèi)力等缺點(diǎn)，完全滿足不了植保工 作精準(zhǔn)、快速防控的要求。為了解決白術(shù)根腐病快速蔓延的現(xiàn)狀，實(shí)現(xiàn)快速、精準(zhǔn)的鑒定角 擔(dān)菌引起的白術(shù)根腐病的目的，急需建立一種能夠?qū)崿F(xiàn)"快速"與"準(zhǔn)確"目標(biāo)要求的角擔(dān) 菌引起的白術(shù)根腐病的檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明要解決的問題是提供一種白術(shù)根腐病菌檢測用引物及快速檢測方法。
[0004] 本發(fā)明一種白術(shù)根腐病菌檢測用引物，其特征在于：所述白術(shù)根腐病菌檢測用引 物的序列為：
[0005] 上游引物JDTY1F:5' -ACAGACTGTGGGGACTTTATTGAAC-3'
[0006]下游引物JDTY1R:5 ' -AGCAGTTGTGAAACTGCAAAGACCT-3 '。
[0007] 本發(fā)明一種白術(shù)根腐病菌檢測用引物，其特征在于：所述白術(shù)根腐病菌檢測用引 物JDTY1F和JDTY1R對白術(shù)根腐病菌特異性擴(kuò)增出337bp的產(chǎn)物。
[0008] 本發(fā)明一種白術(shù)根腐病菌檢測用引物，其特征在于：所述白術(shù)根腐病菌檢測用引 物特異引物序列獲得方法為：以感染根腐病的白術(shù)植株為樣品，采用CTAB法提取樣品基因 組DNA，于-20°C保存；以樣品DNA為模板，利用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS的通用引物 ITS1和ITS4經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0009] 引物序列為：ITS1 :5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3' ；
[0010] ITS4 :5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' ；
[0011] 以第一輪PCR產(chǎn)物為模板稀釋后，利用設(shè)計(jì)的特異引物JDTY1F/JDTY1R進(jìn)行第二 輪PCR擴(kuò)增。
[0012] 本發(fā)明一種白術(shù)根腐病菌檢測用引物，其特征在于：所述的第一輪擴(kuò)增的PCR反 應(yīng)體系總體積為25μ1，反應(yīng)組分為：2XTaqMasterMix12. 5μ1，10μΜ的上下游引物 ITS1/ITS4各lyl，DNAΙμL，雙蒸水9. 5μ1 ;擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5分鐘，94°C變 性30秒，54°C1分鐘，72°C1分鐘，共30個循環(huán)，72°C延伸3分鐘，16°C保存。
[0013]本發(fā)明一種白術(shù)根腐病菌檢測用引物，其特征在于：所述的第二輪擴(kuò)增的反應(yīng)體 系總體積為25μ1，將第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋10倍，取1μ1作為模板，反應(yīng)組分為：2XTaq MasterMix12·5μ1，10μΜ的上下游引物JDTY1F/JDTY1R各ΙμL，雙蒸水 9·5μ1 ;擴(kuò)增反 應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性3分鐘，94°C變性30秒，55°C30秒，72°C30分鐘，共30個循環(huán)，72°C 延伸3分鐘，16 °C保存。
[0014] 本發(fā)明一種白術(shù)根腐病菌檢測用引物的快速檢測方法，其特征在于：按照以下步 驟檢測：
[0015] (1)以感染根腐病的白術(shù)植株為樣品，采用CTAB法提取樣品基因組DNA ;
[0016] (2)以樣品DNA為模板，利用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS的通用引物ITS1和 ITS4經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0017] (3)以第一輪PCR產(chǎn)物為模板稀釋后，利用設(shè)計(jì)的特異引物JDTY1F/JDTY1R進(jìn)行第 二輪PCR擴(kuò)增；
[0018] (4)取適量步驟（3)的擴(kuò)增產(chǎn)物，采用瓊脂糖凝膠，加入GoldviewI型核酸染色 劑，在電壓140V下電泳20分鐘，于凝膠成像系統(tǒng)下拍照檢測，如果存在337bp的DNA特異 性條帶，則確定所檢測的病菌為角擔(dān)菌。
[0019] 本發(fā)明一種白術(shù)根腐病菌檢測用引物的快速檢測方法，其特征在于：所述步驟 (4)為取7 μ 1擴(kuò)增產(chǎn)物，采用質(zhì)量體積比為1%的瓊脂糖凝膠，進(jìn)行電泳分離，100ml瓊脂糖 膠加入100 μ1質(zhì)量體積比的GoldviewI型核酸染色劑。
[0020] 本發(fā)明解決了白術(shù)根腐病快速蔓延的現(xiàn)狀，實(shí)現(xiàn)快速、精準(zhǔn)的鑒定角擔(dān)菌引起的 白術(shù)根腐病的目的，建立起一種能夠?qū)崿F(xiàn)"快速"與"準(zhǔn)確"目標(biāo)要求的角擔(dān)菌引起的白術(shù) 根腐病的檢測方法，有效提高了檢測角擔(dān)菌引起白術(shù)根腐病的及時性和準(zhǔn)確度。
[0021] 本發(fā)明具有以下突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)：
[0022] (1)本發(fā)明檢測靈敏度極高，可以檢測到10ag/μ1的白術(shù)角擔(dān)菌基因組DNA，較角 擔(dān)菌常規(guī)PCR檢測方法靈敏度提高十萬倍，即使在潛伏期或者感染極其輕微的情況下也能 準(zhǔn)確檢測出角擔(dān)菌
[0023] (2)本發(fā)明針對白術(shù)角擔(dān)菌基因組DNA可以擴(kuò)增出337bp的單一條帶，特異性強(qiáng)， 不會檢測出稻瘟菌、絲核菌、莖點(diǎn)霉、炭疽菌、鐮刀菌、鏈格孢、核盤菌、稻曲菌、白絹菌及白 術(shù)基因組DNA，受外源基因組DNA干擾小，精準(zhǔn)度高。
[0024] (3)本發(fā)明還有耗時短、操作簡單的特點(diǎn)，不需要復(fù)雜的檢測場所和實(shí)驗(yàn)室，完成 整個檢測程序約3個小時，常規(guī)方法至少需要10-15天。
[0025] (4)本發(fā)明適用于白術(shù)引種檢疫、脫毒種子種苗質(zhì)量檢測，以及白術(shù)抗角擔(dān)菌引起 的根腐病抗性鑒定早期無癥狀植株檢測。
【附圖說明】
[0026] 附圖1是利用特異引物JDTY1F/JDTY1R田間實(shí)際檢測電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0028] 實(shí)施例1
[0029] 本發(fā)明一種白術(shù)根腐病菌檢測用引物及快速檢測方法，包括以下步驟：
[0030] (1)取樣和基因組DNA提?。?br>[0031] 2014年4月在恩施土家族苗族自治州咸豐縣小村鄉(xiāng)白術(shù)種植基地隨機(jī)采集染根 腐病有明顯根腐癥狀的白術(shù)苗7株，染病田但外觀無明顯根腐病癥狀白術(shù)苗7株，然后按照 5-20的順序?yàn)闃悠愤M(jìn)行編號，清理根部土壤，用無菌水沖洗3次，自然晾干，然后按照CTAB 法提取樣品DNA ;
[0032] (2)第一輪擴(kuò)增：
[0033] 分別以5-11樣