采用熒光RT-PCR技術(shù)檢測周氏嚙小蜂Hsp40基因表達(dá)的方法
【專利說明】采用焚光RT-PCR技術(shù)檢測周氏嗤小蜂Hsp40基因表達(dá)的方 法
[0001] 本發(fā)明得到：國家自然科學(xué)基金（31201730);天津市高等學(xué)?？萍及l(fā)展計劃項目 (20110602);天津師范大學(xué)博士基金（52XB1003)及天津市動植物抗性重點實驗室開放基金 的資助。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及用于檢測周氏嚙小蜂Hsp40基因表達(dá)的特異性引 物，更具體的說是一種采用熒光RT-PCR技術(shù)檢測周氏嚙小蜂Hsp40基因表達(dá)的方法。主要 用于周氏嚙小蜂Hsp40基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理及其生態(tài)防治的研究，研究結(jié)果可為科學(xué)利用天 敵昆蟲周氏嚙小蜂進(jìn)行生物防治提供理論基礎(chǔ)。
【背景技術(shù)】
[0003] 熱激蛋白Heatshockprotein(Hsp)是一類在生物體內(nèi)廣泛存在的，對體內(nèi)外 環(huán)境變化極為敏感的高保守性蛋白質(zhì)，廣泛參與了各種生理代謝途徑，近年來已成為生物 研究領(lǐng)域中的一個熱點。根據(jù)其分子量的大小可將其分為不同的蛋白家族，其中Hsp40與 溫度脅迫應(yīng)激性密切相關(guān)。溫度是影響生物體生存至關(guān)重要的環(huán)境因子，只有在一定的溫 度范圍內(nèi)生物體才能進(jìn)行物質(zhì)能量代謝以維持正常生理活動，超出溫度的耐受范圍都會使 生物的生長發(fā)育停滯甚至死亡。一般來說生物體受到高溫或低溫刺激后，蛋白合成量會有 顯著變化，用以增強(qiáng)抗逆境能力。由于熱激蛋白會在脅迫消除后一段時間內(nèi)保持一定的含 量使生物體更好生存，可以認(rèn)為其存在對于生物體適應(yīng)環(huán)境有著重要作用。
[0004] 周氏嗤小蜂CAoi/ioiaciMeaYang是我國重要入侵物種美國白蛾 (Drury)的重要寄生性天敵，體長1. 1-1. 5mm，群集內(nèi)寄生于美國白蛾蛹 中，是抑制美國白蛾的主要天敵因子，對控制美國白蛾的危害起到重要作用。除寄生于美國 白蛾外，還可寄生于鱗翅目的枯葉蛾科、毒蛾科、舟蛾科、尺蛾科、菜蛾科和雙翅目的蠅科、 寄蠅科及鞘翅目的葉甲科和瓢甲科等。
[0005] 通過野外釋放C??抑可以達(dá)到有效防治美國白蛾的目的。然而，在野外環(huán)境 下，C??似的活力會受到多重因素的影響，其中，溫度作為一個主要生態(tài)因素，會影響C craea的生命力。在合適的溫度范圍投放小蜂，才會起到更好的防治效果。
[0006] 實時熒光PCR技術(shù)是在常規(guī)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)。實時熒 光PCR不僅實現(xiàn)了常規(guī)PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，實時熒光PCR技 術(shù)由自動化儀器收集熒光信號，避免了肉眼判斷的主觀性，可進(jìn)一步提高靈敏度；實時熒光 PCR技術(shù)全封閉反應(yīng)，無須PCR后處理，避免污染，保證了結(jié)果的可靠性和重復(fù)性。目前，已 廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域。隨著實時熒光PCR試劑盒的進(jìn)一步開發(fā)，近年 來，實時熒光PCR技術(shù)在動物生態(tài)防治中也得到了廣泛的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是公開一種采用熒光RT-PCR技術(shù)檢測周氏嚙小蜂Hsp40基因表達(dá) 的方法。
[0008] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下： 設(shè)計一種采用熒光RT-PCR技術(shù)檢測周氏嚙小蜂Hsp40基因表達(dá)的特異性引物，其特 征在于包括符合熒光PCR反應(yīng)特點的特異上下游引物：Hsp40-F:5'-AATGGGCGGCACCACTTA -3'；Hsp40-R:5'-CCACCAGGACCACCAAACT-3' ； 以及作為內(nèi)參基因的周氏嚙小蜂GADPH基因特異性上下游引物：GADPH-F: 5'-GAGGTGGTAGAGCCGCTTCC-3' ；GADPH-R:5'-TTTAGCTTTGATCGCGTCGT-3' 組成。
[0009] 本發(fā)明所述特異性引物快速檢測周氏嚙小蜂Hsp40基因表達(dá)的方法，其特征在于 按如下步驟進(jìn)行： (1)使用下述引物進(jìn)行該基因的檢測： 符合熒光PCR反應(yīng)特點的該序列特異上下游引物： Hsp40-F:5'-AATGGGCGGCACCACTTA-3' Hsp40-R:5'-CCACCAGGACCACCAAACT-3' 以及作為內(nèi)參基因的周氏嚙小蜂GADPH基因特異性上下游引物： GADPH-F:5'-GAGGTGGTAGAGCCGCTTCC-3' GADPH-R:5'-TTTAGCTTTGATCGCGTCGT-3' (1)總RNA的提?。翰捎酶鞣N通用的RNA提取方法，從周氏嚙小蜂成體中提取總RNA; (3) cDNA合成：以周氏嚙小蜂總RNA為模板合成cDNA，反應(yīng)體系為20μL; (4) 實時熒光PCR:以上述合成的cDNA為模板，上述（1)中Hsp40-F和Hsp40-R、GADPH-F 和GADPH-R為特異性引物，進(jìn)行實時熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)，每個樣品設(shè)3個平行管，擴(kuò)增后所 得3個平行管的Ct值取平均數(shù)。
[0010] (5)周氏嚙小蜂在不同溫度下Hsp40基因相對表達(dá)量計算： 實時熒光PCR后，當(dāng)目的基因與內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率相近時，采用法計算不同溫 度下Hsp40基因相對于內(nèi)參GADPH基因的mRNA相對表達(dá)量。
[0011] 本發(fā)明所述的檢測方法，其中每條引物分別配制成濃度為25μ mol/L的貯存液， 工作濃度為〇. 5μmol/L。
[0012] 本發(fā)明進(jìn)一步公開了采用熒光RT-PCR技術(shù)檢測周氏嚙小蜂Hsp40基因表達(dá)的特 異性引在制備檢測周氏嚙小蜂適應(yīng)外界環(huán)境變化方面的應(yīng)用。實驗結(jié)果表明：圖1為不同 溫度下周氏嚙小蜂Hsp40基因的相對表達(dá)量。從圖中看出無論是高溫還是低溫都可以影響 周氏嚙小蜂體內(nèi)的Hsp40的表達(dá)。在低溫脅迫的情況下，隨著溫度的不斷降低，周氏嚙小蜂 體內(nèi)的Hsp40的相對表達(dá)量呈上升的趨勢，并且在-7°C時達(dá)到最大表達(dá)量；在高溫脅迫的 情況下，隨著溫度的不斷升高，周氏嚙小峰體內(nèi)的Hsp40的相對表達(dá)量也呈上升的趨勢，但 在40°C時達(dá)到最大表達(dá)量。這對于以后在何種室外溫度下放飛白蛾周氏嚙小蜂防治美國白 蛾具有重要意義。
[0013] 本發(fā)明提供的特異性引物快速檢測周氏嚙小蜂Hsp40基因表達(dá)的方法與現(xiàn)有技 術(shù)相比的有益效果是： (1)本發(fā)明采用的實時熒光RT-PCR技術(shù)與常規(guī)PCR相比，實時熒光PCR技術(shù)由自動 化儀器收集熒光信號，避免了肉眼判斷的主觀性，可進(jìn)一步提高靈敏度；實時熒光PCR技術(shù) 全封閉反應(yīng)，無須PCR后處理，避免污染，保證了結(jié)果的可靠性和重復(fù)性。實時熒光RT-PCR技術(shù)也免除了常規(guī)PCR中的電泳、定量掃描等后續(xù)繁瑣步驟，大大縮短了實驗時間。
[0014] (2)在通過RT-qPCR的方法研究不同溫度下Hsp40基因表達(dá)的變化，結(jié)果顯示在 不同溫度條件下周氏嚙小蜂體內(nèi)的Hsp40基因的表達(dá)水平處于一個動態(tài)過程中，高溫和低 溫脅迫都使周氏嚙小蜂體內(nèi)Hsp40有一個高的表達(dá)量，在40°C和_7°C體內(nèi)表達(dá)量最大。
[0015] (3)因此本發(fā)明提出研究了周氏嚙小蜂適應(yīng)外界環(huán)境的變化，避免受到脅迫因子 對自身的傷害的保護(hù)機(jī)制，對于防治美國白蛾有重大意義，為綠色防治林業(yè)害蟲提供了一 個新的思路和技術(shù)。
[0016] 周氏嚙小蜂熱激蛋白Hsp40基因，其cDNA序列和編碼氨基酸的序列如序列表1、表 2所示。
[0017] 序列表


【附圖說明】
[0018] 圖1為周氏嚙小蜂Hsp40在相同時間不同溫度脅迫下表達(dá)變化。
【具體實施方式】
[0019] 下面結(jié)合實施例說明本發(fā)明，這里所述實施例的方案，不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域的專 業(yè)人員按照本發(fā)明的精神可以對其進(jìn)行改進(jìn)和變化，所述的這些改進(jìn)和變化都應(yīng)視為在本 發(fā)明的范圍內(nèi)，本發(fā)明的范圍和實質(zhì)由權(quán)利要求來限定；其中所用試劑均有市售。本發(fā)明中 所述的提取白蛾周氏嚙小蜂總RNA的提取，cDNA的合成，實時熒光定量RT-qPCR等方法都 是本領(lǐng)域成熟的技術(shù)，試劑盒TransScript?RT、TransStart?TopGreenqPCRSuperMix等 都可以從生產(chǎn)商家購買。
[0020] 實施例1 : 獲得白蛾周氏嚙小蜂Hsp40基因序列 實驗材料取自室內(nèi)傳代培養(yǎng)的白蛾周氏嚙小蜂(培養(yǎng)條件：于人工氣候箱（PQX-350H) 中，溫度25°C，相對濕度60%~80%，無光黑暗)。取羽化后24h內(nèi)的雌性周氏嚙小蜂，于解剖 鏡下切取觸角，立即浸于RNAlater(Ambion公司，A