通過檢測游離核酸診斷結核病的試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學領域，涉及一種通過檢測游離核酸診斷結核病的試劑盒及其 應用。
【背景技術】
[0002] 結核病是嚴重威脅人類健康的傳染性疾病，每年有200萬人死于結核病，其死亡 率在傳染性疾病中僅低于艾滋病排第二。早期快速診斷是控制結核病疫情的重要環(huán)節(jié)，但 目前結核病的臨床診斷面臨很多問題。
[0003] 細菌學檢查是診斷結核病的金標準，但是痰培養(yǎng)敏感性只有50%左右，且只有在 患者排菌期才能檢測到。同時，細菌學培養(yǎng)一般都在1個月后才能出結果，所以存在敏感性 低、診斷周期長等缺點。而影像學檢查作為另一項臨床常規(guī)檢查是發(fā)現(xiàn)和診斷結核病的重 要方式。但影像學結果受主觀性因素影響比較大，不同醫(yī)生、不同醫(yī)院診斷結果差異較大， 因此在診斷特異性上存在不足。而另一項臨床常用的γ-干擾素釋放實驗只能說明受檢者 是否感染過結核分枝桿菌，無法區(qū)分活動性結核病患者及潛伏感染者，因此也不能作為診 斷結核病的確診依據(jù)。
[0004] 近年來分子生物學技術發(fā)展迅速，TB-PCR、GeneXpert等技術為結核病的快速診斷 提供了新途徑。但這些方法僅限于痰標本、新鮮組織、腦脊液等標本，很難應用于血液標本。 其主要原因結核分枝桿菌主要分布在發(fā)病病灶中，除了血行播散等極特殊情況，一般很少 出現(xiàn)在血液中。另外，結核性胸腔積液標本中結核分枝桿菌荷菌量通常很低，不僅培養(yǎng)陽性 率很低（5-10% )，常用分子檢測技術的陽性率也不理想（30-40% )。
[0005] 因此，結核病診斷急需一種能更加準確、快速、方便的新技術方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種通過檢測游離核酸診斷結核病的產(chǎn)品及其應用。
[0007] 所述游離核酸為人體體液中游離于細胞外的微量內(nèi)源性或外源性核酸片段。
[0008] 本發(fā)明所提供的應用具體為：用于檢測體液的游離核酸中是否含有結核分枝桿菌 特異基因的物質在制備診斷或輔助診斷結核病的試劑盒中的應用。
[0009] 在所述應用中，所述用于檢測體液的游離核酸中是否含有結核分枝桿菌特異基因 的物質，包括：（1)從體液中提取游離核酸的物質；（2)檢測游離核酸中是否含有結核分枝 桿菌特異基因的物質。
[0010] 本發(fā)明所提供的用于診斷或輔助診斷結核病的產(chǎn)品，含有用于檢測體液的游離核 酸中是否含有結核分枝桿菌特異基因的物質。
[0011] 進一步，所述用于檢測體液的游離核酸中是否含有結核分枝桿菌特異基因的物 質，包括：（1)從體液中提取游離核酸的物質；（2)檢測游離核酸中是否含有結核分枝桿菌 特異基因的物質。
[0012] 根據(jù)需要，所述產(chǎn)品還可包含數(shù)據(jù)處理裝置；所述數(shù)據(jù)處理裝置內(nèi)設模塊；所述 模塊具有如下功能：根據(jù)所述游離核酸中是否含有所述結核分枝桿菌特異基因的檢測結果 確定待測者是否為結核病患者，若所述待測者的體液中的游離核酸中含有所述結核分枝桿 菌特異基因，則所述待測者為或候選為結核病患者，若所述待測者的體液中的游離核酸中 不含有所述結核分枝桿菌特異基因，則所述待測者不為或候選不為結核病患者。
[0013] 在上述應用和產(chǎn)品中，所述從體液中提取游離核酸的物質可為游離核酸提取試劑 盒。在本發(fā)明的一個實施例中，所述從體液中提取游離核酸的物質具體為Qiagen公司貨號 為55114的游離核酸提取試劑盒和QIAvac24Plus儀器。
[0014] 在上述應用和產(chǎn)品中，所述檢測游離核酸中是否含有結核分枝桿菌特異基因的物 質可為用于檢測結核分枝桿菌的PCR試劑盒。
[0015] 其中，所述結核分枝桿菌特異基因具體可為結核分枝桿菌的IS6110基因（核苷 酸序列如序列表中序列1。相應的，所述檢測游離核酸中是否含有結核分枝桿菌特異基因 的物質可為用于擴增所述結核分枝桿菌的IS6110基因的引物對。在本發(fā)明的一個實施例 中，所述檢測游離核酸中是否含有結核分枝桿菌特異基因的物質具體為中山大學達安基 因股份有限公司的貨號為DA-B052的用于檢測結核分枝桿菌的IS6110基因的PCR試劑 盒；產(chǎn)品名稱是《結核分枝桿菌核酸檢測試劑盒（PCR-熒光法）》，食藥局注冊號：國械注準 20153400357。
[0016] 在本發(fā)明的一個實施例中，所述體液具體為血液或胸腔積液。
[0017] 本發(fā)明開發(fā)了一種通過檢測血液、胸腔積液等臨床常見液體標本中結核分枝桿菌 游離核酸成分進行結核病快速診斷的新產(chǎn)品。由于游離核酸不需要收集結核分枝桿菌活菌 或完整菌體，因此相比其他的核酸檢測方法具有更好的安全性和敏感性。同時該產(chǎn)品可以 在3小時內(nèi)給出結果，具有快速、簡便等特點。
【具體實施方式】
[0018] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0019] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0020] 實施例1、利用體液游離核酸檢測結核分枝桿菌感染
[0021] -、利用血液游離核酸檢測結核分枝桿菌感染
[0022] 本實驗以25例結核病患者、20例其他疾?。?6例肺癌、4例排除結核病的其他感 染性肺部疾?。┗颊呒?0例健康人的外周血為樣本，分別提取全血DNA和血液游離核酸， 通過檢測其中是否含有結核分枝桿菌特異基因來驗證兩種方法對結核病的診斷準確性。其 中，供試的結核病患者為臨床上經(jīng)過臨床癥狀、影像學、細菌學檢查及抗結核試驗性治療有 效等方法確診為結核病的患者，20例其他疾病患者以及10例健康人也是經(jīng)過臨床證實的。 供試人群為自愿同意。
[0023] 1、血液游離核苷酸的提取
[0024] 用EDTA抗凝采血管采集4ml全血，3500rpm離心10分鐘，分離上清用于游離核酸 提取。游離核酸提取試劑盒為Qiagen公司產(chǎn)品，貨號為55114,按照說明書進行操作。具體 流程如下：
[0025] (1)將2ml待提取樣品移入15ml離心管，加入200μ1蛋白酶K，加入1.6mlACL 緩沖液（含1μgcarrierRNA)。渦旋振蕩30s后，在60°C水浴孵育30min。
[0026] (2)加入3. 6mlACB緩沖液，渦旋振蕩30s后，在冰上放置5min。
[0027](3)將DNA純化柱固定在QIAvac24Plus儀器上（Qiagen公司產(chǎn)品），將步驟（2) 中所有液體轉移至純化柱上。
[0028] (4)打開QIAvac24Plus儀將液體全部抽干后，加入600μ1ACW1緩沖液。抽干后 再加入750μ1ACW2緩沖液。再次抽干后加入750μ1無水乙醇抽干。
[0029] (5)將純化柱轉移至新的收集管上，14000rpm離心3min去流出液。在56°C金屬浴 孵育10分鐘。
[0030] (6)加入50μ1AVE緩沖液，在室溫放置3min后，14000rpm離心lmin，收集流出液 為純化好的游離核酸。置于_20°C保存。
[0031] 2、全血DNA的提取
[0032] 全血DNA提取試劑盒為Qiagen公司產(chǎn)品，其貨號為51183,按照說明書進行操作。 具體流程如下：
[0033] (1)用EDTA抗凝管抽取2ml血液，并移至15ml離心管。
[0034] (2)加入200μ1蛋白酶K，加入2. 4mlAL緩沖液，顛倒混勻15次后渦旋振蕩lmin。
[0035] (3) 70°C水浴中孵育lOmin，加入2ml無水乙醇，顛倒混勻10次后渦旋振蕩lmin。
[0036] (4)將所有液體轉移至DNA離心柱上，3000rpm離心3min去除流出液。
[0037] (5)加入2mlAW1緩沖液，5000rpm離心lmin，棄流出液。加入2mlAW2緩沖液， 5000rpm離心15min，棄流出液。
[0038] (6)將離心柱轉移至新15ml離心管，加入150μ1AE緩沖液，室溫孵育5min， 5000rpm離心2min，收集流出液為全血DNA。置于-20°C保存。
[0039] 3、熒光定量PCR法檢測結核分枝桿菌特異基因序列<