制備成熟胰島素多肽的方法
【專利說(shuō)明】制備成熟胰島素多肽的方法 技術(shù)背景
[0001] 本發(fā)明涉及制備成熟胰島素多肽的重組蛋白表達(dá)和蛋白化學(xué)。
[0002] 背景 胰島素是在胰島β細(xì)胞中產(chǎn)生的多肽激素。有活性的胰島素分子是由通過(guò)兩個(gè)二硫 鍵相連的Β-鏈和Α-鏈組成的雙鏈分子。胰島素以結(jié)構(gòu)為B-C-A的前體分子胰島素原形式 合成，其中C-肽鏈將Β-鏈的C-末端氨基酸殘基與Α-鏈的Ν-末端氨基酸殘基相連。成熟 的雙鏈胰島素通過(guò)在位于與Α-鏈和Β-鏈的接點(diǎn)處的堿性氨基酸殘基對(duì)處體內(nèi)切割C-肽 而形成。Α-鏈和Β-鏈通過(guò)分別位于Α7和Β7以及Α20和Β19Cys殘基之間的兩個(gè)二硫鍵 保持在一起。此外，生物學(xué)活性的胰島素分子在A6和All位Cys殘基之間有一個(gè)內(nèi)部二硫 鍵。
[0003] 已經(jīng)描述了在基因修飾宿主細(xì)胞例如大腸桿菌和酵母中生產(chǎn)胰島素及其前體的 許多方法。在大多數(shù)酵母工藝中，具有或天然C-肽或修飾的C-肽的胰島素前體被表達(dá)和 從酵母細(xì)胞中分泌出來(lái)。W090/10075公開(kāi)了具有C-肽AAK的胰島素前體。W001/49742公 開(kāi)了具有包含芳族氨基酸殘基的C-肽的胰島素前體。W002/079251公開(kāi)了具有包含Gly殘 基的C-肽的胰島素前體。W002/079250公開(kāi)了具有包含Pro殘基的C-肽的胰島素前體。 TO02/100887公開(kāi)了具有包含糖基化位點(diǎn)的C-肽的胰島素前體。W02008/037735公開(kāi)了 具有包含kex2p切割位點(diǎn)的C-肽的胰島素前體。W02011/099028公開(kāi)了降低在畢赤酵母 (/VcAia6·/?)中產(chǎn)生的胰島素或胰島素類似物前體分子的0-糖基化水平的方法。
[0004] 如果沒(méi)有直接獲得成熟胰島素或胰島素類似物產(chǎn)物，則在一個(gè)或多個(gè)后續(xù)的體外 酶促步驟中通過(guò)切割C-肽和可能的N-末端延伸而獲得。這些酶促步驟是耗時(shí)的，常常是 昂貴的，并且具有引入額外相關(guān)雜質(zhì)（即類似成熟的胰島素多肽的雜質(zhì)）的風(fēng)險(xiǎn)。胰島素 多肽的酵母表達(dá)的另一個(gè)挑戰(zhàn)是胰島素多肽的0-糖基化。0-糖基化胰島素多肽也是相關(guān) 雜質(zhì)。對(duì)于所有相關(guān)雜質(zhì)而言相同的是，它們?cè)诩夹g(shù)上難以除去，并由此在商業(yè)純化工藝中 除去花費(fèi)多。這是因?yàn)樾枰~外的純化步驟，通常是色譜步驟，或需要在經(jīng)濟(jì)上不利的條件 下操作色譜步驟。相關(guān)雜質(zhì)的結(jié)果是，這樣的色譜步驟可能在較長(zhǎng)周期內(nèi)、較低的柱載量、 或甚至較低的收率下操作。
[0005] 在制藥工業(yè)中胰島素產(chǎn)品越來(lái)越多地由胰島素多肽的衍生物構(gòu)成并且這類藥物 產(chǎn)品越來(lái)越多地用于非注射遞送。因此，胰島素市場(chǎng)已經(jīng)變成競(jìng)爭(zhēng)性市場(chǎng)并變?yōu)槊恳粍┬?要更多胰島素多肽的產(chǎn)品，所以需要成本上更有效的工藝用于制備胰島素多肽。
[0006] 因此，需要在工業(yè)生產(chǎn)工藝中通過(guò)真菌制備人胰島素或其類似物，其胰島素前體 分子具有減少的〇-糖基化。也需要具有胰島素前體的較高收率并且可通過(guò)有效和簡(jiǎn)單的 工藝使得胰島素前體順從于C-肽的蛋白水解切除的工業(yè)生產(chǎn)工藝。
[0007] 概述 本發(fā)明提供新的連接肽（C-肽），當(dāng)其在轉(zhuǎn)化的微生物、尤其是酵母中表達(dá)時(shí)，賦予 胰島素前體分子的高收率。新的連接肽當(dāng)在真菌例如酵母中表達(dá)時(shí)也促進(jìn)通常低水平的 0-糖基化。在具有降低0-糖基化能力的真菌菌株中表達(dá)新的胰島素前體進(jìn)一步降低了所 表達(dá)的0-糖基化的胰島素前體的比例。這類胰島素前體隨后可通過(guò)一個(gè)或多個(gè)合適的、公 知的轉(zhuǎn)化步驟而轉(zhuǎn)化為人胰島素、desB30人胰島素、其它胰島素類似物或某些胰島素衍生 物。
[0008] 依據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了制備成熟人胰島素或其類似物的方法，即通過(guò) 培養(yǎng)包含編碼人胰島素或其類似物的前體的DNA序列的真菌細(xì)胞，所述前體具有序列 Z-B-X-Y-A，其中 -Z是任選的延伸序列， -B是人胰島素或其類似物的B-鏈， -X是選自以下的序列：X1M、EA、AE、AD、DA和AP，其中X1是包含l-3個(gè)氨基酸殘基的 序列， -Y是K或R，和 -A是人胰島素或其類似物的A-鏈。
[0009] 依據(jù)本發(fā)明第二方面，提供了包含序列Z-B-X-Y-A的胰島素前體，其中 -Z是任選的延伸序列， -B是人胰島素或其類似物的B-鏈， -X是選自以下的序列：X1M、EA、AE、AD、DA和AP，其中X1是包含l-3個(gè)氨基酸殘基的 序列， -Y是K或R，和 -A是人胰島素或其類似物的A-鏈。
[0010] 依據(jù)本發(fā)明第三方面，提供了在真菌細(xì)胞中表達(dá)期間降低人胰島素或人胰島素類 似物的前體的〇-糖基化的方法，所述方法包括（i)在表達(dá)所述人胰島素或人胰島素類似物 的前體的合適培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)包含編碼人胰島素或其類似物的前體的DNA序列的真菌細(xì) 胞，所述前體具有序列Z-B-X-Y-A，其中 -Z是任選的延伸序列， -B是人胰島素或其類似物的B-鏈， -X是選自以下的序列：X1M、EA、AE、AD、DA和AP，其中X1是包含l-3個(gè)氨基酸殘基的 序列， -Y是K或R，和 -A是人胰島素或其類似物的A-鏈。
[0011]依據(jù)本發(fā)明第四方面，提供了在真菌細(xì)胞中表達(dá)期間增加人胰島素或人胰島素類 似物的前體的收率的方法，所述方法包括（i)在表達(dá)所述人胰島素或人胰島素類似物的前 體的合適培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)包含編碼人胰島素或其類似物的前體的DNA序列的真菌細(xì)胞， 所述前體具有序列Z-B-X-Y-A，其中 -Z是任選的延伸序列， -B是人胰島素或其類似物的B-鏈， -X是選自以下的序列：X1M、EA、AE、AD、DA和AP，其中X1是包含l-3個(gè)氨基酸殘基的 序列， -Y是K或R，和 -A是人胰島素或其類似物的A-鏈。
[0012] 本發(fā)明的方法提供了優(yōu)于先前描述的通過(guò)培養(yǎng)真菌細(xì)胞制備成熟人胰島素或其 類似物的方法的許多優(yōu)勢(shì)。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的胰島素前體在真菌中以非常高的收率 表達(dá)。已經(jīng)驚奇地發(fā)現(xiàn)新的胰島素前體也導(dǎo)致低量的0-糖基化胰島素前體形式的相關(guān)雜 質(zhì)。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，通過(guò)使用不同的蛋白甘露糖基轉(zhuǎn)移酶敲除菌株，可將低量的〇-糖基化胰 島素前體甚至進(jìn)一步降低達(dá)2-4倍。因此，目標(biāo)是提供在真菌中展現(xiàn)高表達(dá)水平的胰島素 前體以及所表達(dá)的胰島素前體具有低水平的〇-糖基化。由于，驚奇地發(fā)現(xiàn)同時(shí)可通過(guò)選擇 胰島素前體中的C-肽以及通過(guò)使用PMT調(diào)節(jié)的菌株二者降低0-糖基化水平，高表達(dá)收率 仍然是重要的。
[0013] 降低0-糖基化允許優(yōu)化上游發(fā)酵工藝以及同時(shí)優(yōu)化下游轉(zhuǎn)化和純化工藝，其中 任何0-糖基化形式最終必須被除去。本發(fā)明的胰島素前體此外通過(guò)蛋白酶切割而促進(jìn)有 效成熟，所述蛋白酶例如水解無(wú)色桿菌droazoAacter 蛋白酶（ALP)。因此，發(fā) 酵收率、〇-糖基化和ALP切割的這種組合優(yōu)化的結(jié)果允許明顯更高的發(fā)酵收率，明顯更高 的純化柱載量，和甚至從目前使用的工藝中取消了純化步驟以及流線型（streamlined)ALP 切割反應(yīng)步驟。所得全工藝因此增加了生產(chǎn)工廠的能力，同時(shí)降低了生產(chǎn)胰島素多肽所需 的原材料的量。這兩種結(jié)果都促使胰島素多肽成本下降。
[0014] 用作表達(dá)人胰島素或人胰島素類似物的前體的宿主細(xì)胞的真菌細(xì)胞可以攜帶降 低其0-糖基化能力的至少一個(gè)遺傳修飾。本發(fā)明的連接肽X-Y，導(dǎo)致從真菌細(xì)胞中分泌出 來(lái)的胰島素前體的低0-糖基化。然而，對(duì)于一些C-肽，通過(guò)在具有降低0-糖基化的能力 的真菌細(xì)胞中表達(dá)，得到甚至更低水平的0-糖基化。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述降低真菌細(xì) 胞ο-糖基化能力的遺傳修飾是在PMT1或PMT2的基因內(nèi)的至少一個(gè)遺傳修飾。
[0015] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在序列Z-B-X-Y-A中的連接肽X-Y是XW-Y，其中Xi 是包含1-3個(gè)氨基酸殘基的序列。因此，一方面本發(fā)明涉及胰島素前體，其包含可從A鏈和 B鏈上切割下來(lái)的連接肽（X-Y)和包含至少一個(gè)Μ和使得A-鏈和連接肽之間的肽鍵能夠被 切割的切割位點(diǎn)，其中一個(gè)Μ是緊接在所述切割位點(diǎn)的Ν-末端。
[0016] 本發(fā)明的另一方面涉及胰島素前體，其包含可從Α鏈和Β鏈上切割下來(lái)的并由3-5 個(gè)氨基酸殘基組成的連接肽（C-肽），所述3-5個(gè)氨基酸殘基其中至少一個(gè)是Μ殘基。
[0017] 本發(fā)明也涉及多核苷酸序列，其編碼要求保護(hù)的胰島素前體。再一方面本發(fā)明涉 及含有所述多核苷酸序列的載體和含有所述多核苷酸序列或載體的宿主細(xì)胞。
[0018] 附圖簡(jiǎn)述 圖1顯示ρΑΚ1119釀酒酵母（5：ceiwisiae)表達(dá)質(zhì)粒，其表達(dá)α*-前導(dǎo)序列（無(wú)BglII-位點(diǎn)）（SEQIDN0:l)-EEGEPK(SEQIDN0:2)-胰島素前體融合蛋白。
[0019] 圖2顯示pAK1119DNA表達(dá)盒的核苷酸序列（SEQIDΝ0:5)和所編碼的融合蛋白 (ΡΑΚ1119的α*-前導(dǎo)序列-EEGEPK-胰島素前體（SEQIDΝ0:6)的推定的氨基酸。
[0020] 圖3顯示ρΑΚ3768釀酒酵母表達(dá)質(zhì)粒，其表達(dá)α2-前導(dǎo)序 列-EEGEPK-B(l-29)-AlaXLys-A(l-21)前體。
[0021] 圖4顯示pAK3768DNA表達(dá)盒的核苷酸序列（SEQIDN0:9)和所編碼的融合蛋白 (PAK3768的α2-前導(dǎo)序列-EEGEPK-胰島素前體（SEQIDN0:10)的推定的氨基酸。
[0022] 圖5顯示pAK4053釀酒酵母表達(dá)質(zhì)粒，其表達(dá)TA39-前導(dǎo)序列-EEGEPK-B(1-29)-A laMetLys-A(1-21)前體。
[0023] 圖6顯示pAK4053DNA表達(dá)盒的核苷酸序列（SEQIDN0:11)和所編碼的融合蛋 白（PAK4053的TA39-前導(dǎo)序列-EEGEPK-胰島素前體（SEQIDN0:12))的推定的氨基酸。
[0024] 描述 依據(jù)本發(fā)明第一方面，提供了制備成熟人胰島素或其類似物的方法，即通過(guò)培養(yǎng)包含 編碼人胰島素或其類似物的前體的DNA序列的真菌細(xì)胞，所述前體具有序列Z-B-X-Y-A，其 中 -Z是任選的延伸序列， -.B是人胰島素或其類似物的B-鏈， X是選自以下的序列4M、EA、AE、AD、DA和AP，其中Xi是包含1-3個(gè)氨基酸殘基的 序列， -Y是K或R，和 -A是人胰島素或其類似物的A-鏈。
[0025] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"胰島素類似物"是指修飾的人胰島素，其中胰島素的一個(gè)或多個(gè) 氨基酸殘基已被其它氨基酸殘基取代和/或其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基已從胰島素上缺 失和/或其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基已經(jīng)添加和/或插入到胰島素。相比人胰島素，胰島 素類似物通常會(huì)包含不超過(guò)大約7個(gè)突變、更通常不超過(guò)5個(gè)和甚至更通常最多3個(gè)突變。 在一個(gè)實(shí)施方案中，相比人胰島素，胰島素類似物包含小于10個(gè)氨基酸修飾（取代、缺失、 添加（包括插入）及其任何組合），或者相比人胰島素，小于9、8、7、6、5、4、3、2或1個(gè)修飾。
[0026]胰島素分子中的修飾表示為鏈（A或B)、位置和取代氨基酸殘基的氨基酸殘基的 單字母編碼。此處的術(shù)語(yǔ)如"ΑΓ'、"Α2"和"A3"等分別是指在胰島素的A鏈中（自N-末端 開(kāi)始計(jì)數(shù)）的位置1、2和3等的氨基酸。同樣，術(shù)語(yǔ)例如B1、B2和B3等分別是指在胰島素 的B鏈中（自N-末端開(kāi)始計(jì)數(shù)）的位置1、2和3等的氨基酸。使用氨基酸的單字母編碼， 術(shù)語(yǔ)如A21A、B28K和B29P是指A21位置的氨基酸是A，位置28和29的氨基酸分別是賴氨 酸和脯氨酸。
[0027] 因此，例如，B28K，B29P人胰島素是人胰島素類似物，其中B鏈中的位置28的氨基 酸被賴氨酸取代，B鏈中的位置29的氨基酸被脯氨酸取代，A鏈?zhǔn)茿(1-21)