同的 修飾的寡核苷酸轉(zhuǎn)染Panc-Ι細(xì)胞和RenCa細(xì)胞（自主轉(zhuǎn)染或無協(xié)助轉(zhuǎn)染或自主遞送），并 在轉(zhuǎn)染后72小時測量TGF-β1 (黑色柱）、TGF-β2 (白色柱）和TGF-β3 (條紋柱）mRNA表 達(dá)的抑制。圖3分別是以下修飾的寡核苷酸的結(jié)果：ASPH190、ASPH191、ASPH192、ASPH193、 ASPH194、ASPH195、ASPH196、ASPH197、ASPH198、ASPH199、ASPH200、ASPH201、ASPH202、 ASPH203、ASPH204、ASPH205、ASPH206、ASPH207、ASPH208、ASPH209、ASPH210、ASPH211、 ASPH212、ASPH213、ASPH214、ASPH215、ASPH216、ASPH217、ASPH218、ASPH219、ASPH220、 ASPH221、ASPH222和ASPH223。圖3a顯示Panc-1細(xì)胞中這些TGF-β寡核苷酸的抑制作用 且圖3b是在RenCa細(xì)胞中的結(jié)果。
[0020] 圖4顯示本發(fā)明的寡核苷酸對TGF-β1和TGF-β2蛋白質(zhì)表達(dá)的抑制作用。使用 20、6. 67、2. 22、0. 74、0. 25、0. 08 或 0. 009μΜ的修飾的寡核苷酸ASPH47 感染人Panc-Ι細(xì) 胞（圖 4a)。陰性對照是濃度為 40、13. 33、4· 44、L48、0· 49、0· 16、0· 05 或 0· 02μΜ的SEQ IDNo. 22的錯義寡核苷酸（scrLNA)(圖4b)。通過ELISA測定細(xì)胞上清液中的TGF-β1 (菱 形）和TGF-β2(方形）蛋白質(zhì)水平。
[0021] 發(fā)明詳沐
[0022] 本發(fā)明涉及寡核苷酸，特別是反義寡核苷酸，其包含至少一個修飾的核苷酸并適 用于與TGF-βmRNA(優(yōu)選TGF-β1、TGF-β2和/或TGF-β3)相互作用。這些寡核苷酸包 含或由SEQIDNO. 1的TGF-β2核酸的10-18個核苷酸組成。最優(yōu)選的寡核苷酸包含或由 10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸組成。該寡核苷酸是單鏈或雙鏈RNA或DNA，包 括siRNA、微小RNA、適體或鏡像體（spiegelmer)。優(yōu)選地，該寡核苷酸是反義寡核苷酸。
[0023]優(yōu)選的本發(fā)明的寡核苷酸分別是ASPH47、ASPH190、ASPH191、ASPH192、ASPH193、 ASPH194、ASPH195、ASPH196、ASPH197、ASPH198、ASPH199、ASPH200、ASPH201，和ASPH202、 ASPH203、ASPH204、ASPH205、ASPH206、ASPH207、ASPH208、ASPH209、ASPH210、ASPH211、 ASPH212、ASPH213、ASPH214、ASPH215、ASPH216、ASPH217、ASPH218、ASPH219、ASPH220、 ASPH221、ASPH222和ASPH223。本發(fā)明的反義寡核苷酸可以不同方式描述，例如ASPH47、 ASPH0047、ASPH_47 或ASPH_0047 指同一寡核苷酸。
[0024] 核苷酸形成寡核苷酸的結(jié)構(gòu)模塊，且例如由以下物質(zhì)組成：核堿基（含氮堿基，如 嘌呤或嘧啶）、五碳糖（如核糖、2-脫氧核糖、阿拉伯糖、木糖、來蘇糖、阿洛糖、阿卓糖、葡萄 糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔羅糖或這些糖的穩(wěn)定化的修飾體）和一個或多個磷 酸基團(tuán)。修飾的磷酸基團(tuán)的示例是硫代磷酸酯或甲基膦酸酯。各種核苷酸的化合物都是可 修飾的，且是天然產(chǎn)生的或非天然產(chǎn)生的。后者是，例如，鎖核酸（LNA)、2'-0,4'_C-乙烯橋 接核酸（ΕΝΑ)、聚環(huán)氧烷（如三甘醇（TEG))、2' -氟、2' -0-甲氧基和2' -0-甲基修飾的核苷 酸，參見例如Freier和Altmann(Nucl.AcidRes.，1997, 25, 4429-4443)和Uhlmann(Curr· OpinioninDrug&Development(2000, 3 (2) :293-213))，其不于圖 2〇
[0025]LNA是一種修飾的RNA核苷酸，其中，核糖部分被連接2'氧和4'碳的額外橋修飾 (2'-4'核糖核苷）。該橋?qū)⒑颂?鎖定"為3'-內(nèi)（北）構(gòu)象，其通常發(fā)現(xiàn)于A型雙鏈體 中。LNA核苷和核苷酸分別包含例如硫代-LNA、氧基-LNA或氨基-LNA的形式（以a-D-或 β-L-構(gòu)型），且與寡核苷酸中DNA或RNA殘基分別是可混合和可合并的。
[0026] 本發(fā)明的寡核苷酸（即修飾的寡核苷酸）在寡核苷酸的5'和/或3'端包含至少 一個修飾的核苷酸（優(yōu)選LNA和/或ΕΝΑ)。在優(yōu)選的實施方式中，該寡核苷酸包含位于5' 端的1、2、3或4個LNA或ΕΝΑ和位于3'端的1、2、3或4個LNA或ΕΝΑ。在另一個優(yōu)選的實 施方式中，該寡核苷酸包含位于5'端或3'端的1、2、3或4個LNA或ΕΝΑ，以及位于3'或 5'端的聚環(huán)氧烷（如TEG)。這些修飾的寡核苷酸分別顯示對TGF-β表達(dá)和活性的顯著提 高的抑制，其導(dǎo)致改善的對某些疾病的預(yù)防和/或治療，這些疾病是惡性或良性腫瘤、免疫 疾病、纖維化、眼疾病（如干眼病、青光眼或后囊膜混濁（PC0))、CNS疾病、脫發(fā)等。本發(fā)明 的寡核苷酸通過以下方式靶向TGF-β相關(guān)的疾?。号cTGF-i3mRNA(優(yōu)選TGF-βUTGF-β2 或TGF-I3 3)雜交。
[0027] 優(yōu)選合并兩種或更多種寡核苷酸，其中，至少一種寡核苷酸特異性抑制TGF-β1 且至少一種寡核苷酸特異性抑制TGF-β2,或至少一種寡核苷酸特異性抑制TGF-β1且至 少一種寡核苷酸特異性抑制TGF-β3,或至少一種寡核苷酸特異性抑制TGF-β2且至少一 種寡核苷酸特異性抑制TGF-β3,或至少一種寡核苷酸特異性抑制TGF-β1且至少一種寡 核苷酸特異性抑制TGF-β2且至少一種寡核苷酸特異性抑制TGF-β3。本發(fā)明的寡核苷酸 最優(yōu)選抑制TGF-β2mRNA的表達(dá)和/或活性。
[0028] 在另一個實施方式中，一種寡核苷酸抑制兩種TGF-β同種型，例如TGF-β1 和TGF-β2、TGF-β2和TGF-β3或TGF-β1和TGF-β3。抑制兩種或全部三種同種型 (TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3)表達(dá)的寡核苷酸被定義為泛特異性寡核苷酸。
[0029] 在另一個實施方式中，組合三種或更多種寡核苷酸，其中，至少一種寡核苷酸特 異性抑制TGF-β1，另一種寡核苷酸特異性抑制TGF-β2,且另一種寡核苷酸特異性抑制 TGF-β3,且任選地一種或多種其他寡核苷酸抑制TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3。
[0030] 本發(fā)明的寡核苷酸的IC5。范圍是，例如，0. 1至20μΜ，優(yōu)選ο. 2至15μΜ，更優(yōu) 選0. 4至10μΜ，且甚至更優(yōu)選〇. 5至5μΜ。
[0031] 本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，其包含本發(fā)明的寡核苷酸作為活性成分。該藥物 組合物包含至少一種本發(fā)明的寡核苷酸且任選還包含反義化合物、抗體、化療化合物、抗炎 化合物、抗病毒化合物和/或免疫調(diào)節(jié)化合物。藥物組合物任選包含藥學(xué)上可接受的結(jié)合 劑和佐劑。
[0032] 在一個實施方式中，寡核苷酸和藥物組合物分別配制為包含粘合劑、賦形劑、穩(wěn)定 劑等的溶液形式的劑量單位。
[0033] 該寡核苷酸和/或藥物組合物可通過不同途徑給予。這些給藥途徑包括但不限 于：電穿孔、表皮、壓印至皮膚（impressionintoskin)、動脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、顏內(nèi)、皮內(nèi)、傷口 內(nèi)、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、眼內(nèi)、鞘內(nèi)、房內(nèi)、腹膜內(nèi)、前列腺內(nèi)、肺內(nèi)、椎管內(nèi)、氣管內(nèi)、瘤內(nèi)、靜脈內(nèi)、粘 膜內(nèi)、放置于身體腔內(nèi)、鼻吸入、口服、肺吸入（通過吸入或吹入粉末或氣溶膠，包括通過噴 霧器）、皮下、真皮下、局部（包括眼科和至粘膜，包括陰道和直腸遞送）或透皮。
[0034] 對于胃腸道外、皮下、皮內(nèi)或局部給藥，該寡核苷酸和/或藥物組合物包含例如無 菌稀釋劑、緩沖劑、毒性調(diào)節(jié)劑和抗菌劑。在優(yōu)選的實施方式中，該寡核苷酸或藥物組合物 使用保護(hù)免于降解或立即清除出身體的運載體制備，包括具有受控釋放性質(zhì)的植入物或微 膠囊。對于靜脈內(nèi)給藥，優(yōu)選的運載體是例如生理鹽水或磷酸鹽緩沖鹽水。用于口服給藥 的寡核苷酸和/或包含這類寡核苷酸的藥物組合物包括例如粉末劑或顆粒劑、微粒、納米 微粒、水或非水介質(zhì)中的混懸劑或溶液劑、膠囊劑、凝膠膠囊劑、囊袋、片劑或小型片劑。用 于胃腸道外、鞘內(nèi)、房內(nèi)或囊泡內(nèi)給藥的寡核苷酸和/或藥物組合物包含例如無菌水溶液， 其任選含有緩沖劑、稀釋劑和其他合適的添加劑（如透過增強(qiáng)劑、運載體化合物和其他藥 學(xué)上可接受的運載體或賦形劑）。
[0035] 藥學(xué)上可接受的運載體是例如液體或固體，且根據(jù)計劃的給藥方式選擇，從而在 與核酸和給定藥物組合物的其他組分合并時提供所需體積、持久性等。典型的藥學(xué)上可接 受的運載體包括但不限于：粘合劑（如預(yù)膠化玉米淀粉、聚乙烯基吡咯烷酮或羥丙基甲