利用陽離子交換層析純化蛋白質(zhì)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)純化領(lǐng)域，具體涉及利用陽離子交換層析方法純化含有污染物 的抗體。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著生物工程技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的包括抗體在內(nèi)的蛋白質(zhì)通過生物反應(yīng) 器（如工程菌或工程細胞株）或其他方式進行大規(guī)模的制備，對獲得的含有目的蛋白質(zhì)培 養(yǎng)物進行分離純化是其生產(chǎn)過程下游技術(shù)中必不可少的步驟，如何通過對蛋白質(zhì)純化方法 的改進，優(yōu)化蛋白質(zhì)的純化條件，進一步增加去除污染物的效率，提高蛋白質(zhì)的純度和收率 等是蛋白質(zhì)工業(yè)化生產(chǎn)中一直存在的問題。
[0003] 利用工程菌或工程細胞株表達目的蛋白質(zhì)方法一般是將含有目的基因的重組載 體導入到宿主細胞中，在合適的條件下進行細胞培養(yǎng)，從而獲得目的蛋白質(zhì)的表達。獲得的 培養(yǎng)物中除了目的蛋白外，還包括宿主細胞蛋白（Host cell protein，HCP)、宿主細胞DNA、 RNA、培養(yǎng)基組分、目的蛋白變體和/或聚集體、目的蛋白片段、以及可能存在的毒素、病毒、 微生物等在內(nèi)的其他污染物等；因此必須通過一系列的純化過程才能獲得較純的符合應(yīng)用 目的的蛋白質(zhì)。
[0004] 離子交換層析（Ion Exchange Chromatography簡稱為IEC)是目前生物化學領(lǐng)域 中常用的一種純化方法。離子交換層析是以離子交換劑為固定相，根據(jù)流動相中的組分離 子與交換劑上的平衡離子通過可逆交換從而達到分離目的的一種層析方法。所謂離子交 換，是指溶液中的某一種離子與另一種合在載體上的離子進行可逆交換的過程，即溶液中 的離子結(jié)合到載體上而載體上的離子被替換下來。若載體上結(jié)合著帶正電荷的活性基團， 則可交換陰離子，為陰離子交換劑；若載體上結(jié)合著帶負電荷的活性基團，則可交換陽離 子，為陽離子交換劑。在一定的條件下，混合物中不同蛋白質(zhì)所帶電荷的性質(zhì)及電荷多少不 同，有的能與特定離子交換劑結(jié)合，有的不能結(jié)合；能與離子交換劑結(jié)合的蛋白質(zhì)中，結(jié)合 力的大小也不一定相同，然后采用適當?shù)南疵摋l件，可以對它們進行有效的分離。離子交換 層析目前廣泛的應(yīng)用于各種生化物質(zhì)如氨基酸、蛋白、糖類、核苷酸等的分離純化。
[0005] 由于生物樣品的復雜性以及其它因素影響，一般生物大分子與離子交換劑的結(jié)合 情況較難估計，特別是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的復雜性，它與離子交換劑的結(jié)合力與蛋白質(zhì)分子所攜 帶的電荷的數(shù)目有關(guān)，還與蛋白質(zhì)的分子的大小及電荷排列等其他性質(zhì)也有一定關(guān)系。因 此，針對不同的蛋白質(zhì)特別是用做藥物的抗體，優(yōu)化選擇出合適的離子交換層析純化工藝， 盡可能降低生產(chǎn)成本并提高抗體收率，以獲得較高純度的抗體，往往需要通過大量的實驗 進行摸索。
[0006] 專利200880119331. X公開了一種通過陽離子交換層析純化抗體的方法，其中在 使用電導率升高的洗脫緩沖液來洗脫期望抗體之前使用高pH清洗步驟來清除污染物；通 過在陽離子交換純化方案中包括至少兩個清洗步驟，其中至少第一個在高pH(約pH 6. 8或 更大）進行，能顯著提高純化功效，實現(xiàn)了更高的步驟產(chǎn)率。該專利通過增加在洗脫抗體之 前使用高pH清洗步驟，以清除污染物，但工藝步驟的增多會使工藝時間延長，增加了生產(chǎn) 成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了通過用盡量少的離子交換層析步驟進行純化，降低生產(chǎn)成本，并獲得較高純 度的抗體，本發(fā)明提供了一種陽離子交換層析純化含有污染物的抗體的方法，其包括以下 步驟：
[0008] a)上樣：將含有抗體和污染物的溶液加載到陽離子交換柱上，
[0009] b)清洗：用清洗緩沖液清洗陽離子交換材料，
[0010] C)洗脫：用洗脫緩沖液從陽離子交換材料上洗脫下目的抗體。
[0011] 本發(fā)明通過對各種緩沖液的組成及濃度、pH、電導率等通過大量試驗進行優(yōu)化，達 到了較好的污染物去除效果和較高的收率。
[0012] 本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，清洗緩沖液的電導率為5_9ms/cm，優(yōu)選電導率為 6_8ms/cm〇
[0013] 本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，清洗緩沖液的pH為5. 5-5. 9,優(yōu)選pH為5. 7-5. 9 ;
[0014] 本發(fā)明中的清洗緩沖液中的緩沖物質(zhì)為MES、檸檬酸、磷酸、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其 兩種及兩種以上的混合物；緩沖液中含有選自氯化鉀（KC1)、氯化鈉（NaCl)、碳酸鉀、乙酸 鈉、硫酸鉀、硫酸鈉、檸檬酸鹽、磷酸鹽或這些成分的兩種或多種混合物的鹽類。
[0015] 本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，清洗緩沖液為含有20-25mM MES，40-50mM NaCl的 溶液；
[0016] 本發(fā)明優(yōu)選實施方案中，洗脫緩沖液的電導率為9-14ms/cm，洗脫緩沖液的電導率 優(yōu)選 9-lOms/cm，更優(yōu)選 9. 0-9. 6ms/cm。
[0017] 本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，洗脫緩沖液的pH為5. 5-5. 9,優(yōu)選pH為5. 7-5. 9。
[0018] 本發(fā)明中的洗脫緩沖液中的緩沖物質(zhì)為MES、檸檬酸、磷酸、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其 兩種及兩種以上的混合物；緩沖液中含有選自氯化鉀（KC1)、氯化鈉（NaCl)、碳酸鉀、乙酸 鈉、硫酸鉀、硫酸鈉、檸檬酸鹽、磷酸鹽或這些成分的兩種或多種混合物的鹽類。
[0019] 本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，洗脫緩沖液為含有20-25mM MES，75-110mM NaCl 的溶液，NaCl濃度優(yōu)選80-95mM NaCl。
[0020] 在利用本發(fā)明方法在進行陽離子交換層析之前，期間或之后，可以對含有污染物 的抗體進行一個或多個其他純化步驟。例如可通過深層過濾、蛋白A親和層析的初步純化 后再進行陽離子交換層析，可獲得更好的抗體純化效果。
[0021] 用本發(fā)明的陽離子交換層析純化工藝純化的抗體為結(jié)合人VEGF(人血管內(nèi)皮生 長因子）的抗體或結(jié)合人CD20的抗體。
[0022] 可用于本發(fā)明純化工藝的結(jié)合人VEGF的抗體是指包括與人VEGF結(jié)合的多克隆抗 體、單克隆抗體、具有結(jié)合特異性的抗體片段或抗體的各種修飾形式等；本發(fā)明優(yōu)選可用于 純化的抗VEGF抗體為具有 SEQ ID N0:1(CDR H1)、SEQ ID N0:2(CDR H2)、SEQ ID N0:3(CDR H3)所示的重鏈高變區(qū)序列和 SEQ ID NO :4(CDR LI)、SEQ ID NO :5(CDR L2)、SEQ ID NO : 6(CDR L3)所示的輕鏈高變區(qū)序列的抗體，更優(yōu)選為貝伐單抗（Bevacizumab)。
[0023] 本發(fā)明的抗VEGF抗體可由以下方法獲得：將合成的SEQ ID NO :1-3的重鏈⑶R區(qū) 序列移植人重鏈亞組III構(gòu)架上，SEQ ID NO :4-6的輕鏈⑶R區(qū)序列移植到人輕鏈Κ亞組1 構(gòu)架上，獲得抗VEGF抗體VH和VL序列，再將VH和VL分別克隆到含有人IgG重鏈恒定區(qū) 和輕鏈恒定區(qū)的表達載體上，將含有抗VEGF抗體重鏈和輕鏈的表達載體共轉(zhuǎn)染CH0細胞， 在合適的培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)，CH0細胞表達的抗VEGF抗體分泌到胞外培養(yǎng)基中，收集含 有抗VEGF抗體細胞培養(yǎng)物，將細胞培養(yǎng)物進行初步純化后，獲得用于進一步進行離子交換 層析的含有抗VEGF抗體和污染物的混合物。
[0024] 可用于本發(fā)明純化工藝的結(jié)合人⑶20的抗體是指包括與人⑶20結(jié)合的多克隆抗 體、單克隆抗體、具有結(jié)合特異性的抗體片段或抗體的各種修飾形式等，本發(fā)明優(yōu)選可用的 抗⑶20抗體為具有SEQ ID N0 :7所示的重鏈可變區(qū)序列和SEQ ID N0 :8所示的輕鏈可變 區(qū)序列的抗體，更優(yōu)選為利妥昔單抗（Rituximab)。
[0025] 本發(fā)明的抗⑶20抗體可由以下方法獲得：將合成的SEQ ID N0 :7的重鏈可變區(qū)序 列和SEQ ID N0 :8的輕鏈可變區(qū)序列分別克隆到人IgG重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的表達載 體上，將含有抗CD20抗體重鏈和輕鏈的表達載體共轉(zhuǎn)染CH0細胞，在合適的培養(yǎng)條件下進 行培養(yǎng)，CH0細胞表達的抗CD20抗體分泌到胞外培養(yǎng)基中，收集含有抗CD20抗體的細胞培 養(yǎng)物，將細胞培養(yǎng)物進行初步純化后，獲得用于進一步進行離子交換層析的含有抗CD20抗 體和污染物的混合物。
[0026] 本發(fā)明的另一實施方案中，在上樣之前，將陽離子交換柱用平衡緩沖液進行平衡， 平衡緩沖液可以與清洗緩沖液為同一緩沖液。
[0027] 含有抗體和污染物的溶液上樣溶液在上樣前，通過對上樣溶液pH進行優(yōu)化，上樣 溶液pH值為純化時所選用平衡緩沖液的pH值±0. 05。
[0028] 上樣溶液的電導率根據(jù)離子交換材料的性質(zhì)進行調(diào)節(jié)，如果采用SP-HP等不耐高 鹽的離子交換材料，則需要將上樣溶液的電導率< 3. 5ms/cm，如果采用poros等耐高鹽的 填料則可不需要調(diào)節(jié)上樣溶液的電導率。
[0029] 本發(fā)明的另一實施方案中，所用的交換材料為粒度直徑不大于50μπι左 右的離子交換材料。在一些優(yōu)選的實施方案中，陽離子交換柱所用的交換材料