赫氏顆石藻的培養(yǎng)方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于海洋植物培育技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種培養(yǎng)赫氏顆石藻的方法，本發(fā)明還涉及一種培養(yǎng)赫氏顆石藻的培養(yǎng)基，本發(fā)明還涉及一種赫氏顆石藻特異病毒的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]赫氏顆石藻Emiliania huxleyi是一種廣泛分布于全球近海和大洋的的單細(xì)胞真核微型浮游植物，隸屬于定鞭藻門(Prymnes1phyta)，定鞭藻綱(Prymnes1phyceae)。赫氏顆石藻能夠產(chǎn)生豐富的次級(jí)代謝生物活性物質(zhì)，在醫(yī)藥、食品和日用化工等研究領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，如能有效合成和積累具有防止心血管疾病等藥理功能的Ω-3長(zhǎng)鏈多元不飽和脂肪酸二十二碳六稀酸(DHA) (Sayanova 0, Has lam RP, Caleron MV, etal.1dentificat1n and funct1nal characterisat1n of genes encoding theomega-3polyunsaturated fatty acid b1synthetic pathway from the coccolithophoreEmiliania huxley1.Phytochemistry, 2011, 72 (7): 594-600);能夠合成大量的具有良好的抗菌、抗蟲(chóng)、抗腫瘤等生物學(xué)活性物質(zhì)，如聚酮類化合物(Read BA, Kegel J, Klute MJ, etal.Pan genome of the phytoplankton Emiliania underpins its global distribut1n.Nature, 2013.499 (7457): 209-13)；特別是該藻能夠合成一種新型的神經(jīng)酰胺類物質(zhì)，其具有自然界罕見(jiàn)的特殊結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)的神經(jīng)酰胺具有較高的生物學(xué)活性(MichaelsonLV, Dunn TM, Napier JA.Viral trans-dominant manipulat1n of algal sphingolipids.Plant Sci,2010，15(12):651-655.)。
[0003]神經(jīng)酰胺是細(xì)胞中的一種信號(hào)傳導(dǎo)物質(zhì)，對(duì)細(xì)胞分化、增殖、免疫、凋亡及衰老等生命活動(dòng)具有重要調(diào)節(jié)作用。目前，商品化的天然神經(jīng)酰胺價(jià)格高達(dá)6000美元/kg，美國(guó)每年神經(jīng)酰胺類產(chǎn)品的產(chǎn)值在100億美元以上。作為一種新型的生物活性物質(zhì)，神經(jīng)酰胺特有的生理功能及藥物功效使其成為一種附加值極高并具有巨大市場(chǎng)潛力的活性物質(zhì)，在化工、醫(yī)藥、食品、特別是高檔護(hù)膚品等領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景。目前國(guó)內(nèi)外天然神經(jīng)酰胺產(chǎn)品均為植物源神經(jīng)酰胺，主要從大米、小麥、玉米、米糠和魔芋等原料中提取，但含量甚微，一般占生物量干重的0.01% -0.2%。因此，天然神經(jīng)酰胺產(chǎn)量較低是制約神經(jīng)酰胺功能性產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的瓶頸，使其商業(yè)化應(yīng)用存在經(jīng)濟(jì)性的挑戰(zhàn)。目前已陸續(xù)從海洋生物如，海綿和珊瑚中提取到了新型的神經(jīng)酰胺，而且發(fā)現(xiàn)源于這些海洋生物的神經(jīng)酰胺具有特殊的結(jié)構(gòu)，其生物學(xué)活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于任何陸地生物來(lái)源的神經(jīng)酰胺。與海綿及軟體動(dòng)物珊瑚等相比，海洋微藻生長(zhǎng)快、周期短、易培養(yǎng)且細(xì)胞中總脂含量相對(duì)較高。因而，在生物活性物質(zhì)開(kāi)發(fā)利用中無(wú)疑具有更強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。
[0004]目前，幾乎所有商業(yè)化的微藻培養(yǎng)體系都是在開(kāi)放式池中，但是，并不是所有的物種都能在開(kāi)放式池中培養(yǎng)，如球石藻(coccolithophorid)中的Pleurochrysiscarterae能在戶外跑道式池中生長(zhǎng)至少10個(gè)月，而赫氏顆石藻(E.huxleyi)和I丐板金藻(Gephyrocapsa oceanica)卻不能利用這種方式培養(yǎng)(Moheimani and Borowitzka, 2006)。研究發(fā)現(xiàn)，板式光生物赫氏顆石藻中顆石藻(p.carterae)、赫氏顆石藻(E.huxleyi)和|丐板金藻(G.0ceanica)最理想的封閉培養(yǎng)體系，采用半連續(xù)方式培養(yǎng)，顆石藻(P.carterae)能達(dá)到的最大細(xì)胞密度為4.1 X 105cells.mL \ E.huxleyi能達(dá)到5.9X 105cells.mL \ G.0ceanica能達(dá)到2.4X 105cells.mL、這三種都能在玻璃光生物反應(yīng)器中生長(zhǎng)(Navid R.Moheimani,Andreas Isdepsky, Jan Lisec,et al.Coccolithophoridalgae culture in closed photob1reactors.B1technology and B1engineering，2011，108(9):2078-2087)，而這些培養(yǎng)均在自養(yǎng)條件下利用不含Si的f/2培養(yǎng)基。目前赫氏顆石藻采用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)所能達(dá)到的生物量仍處于較低水平。因此，迫切需要尋找既能提高赫氏顆石藻生物量又能提高細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺積累的培養(yǎng)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種培養(yǎng)赫氏顆石藻的培養(yǎng)基組合物，采用可提高赫氏顆石藻生物量，又可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺積累的培養(yǎng)基組合物，該培養(yǎng)基可使赫氏顆石藻達(dá)到高密度培養(yǎng)的前提下，藻體品質(zhì)與自養(yǎng)培養(yǎng)相比有較大幅度提高。
[0006]本發(fā)明的另一目的是提供一種赫氏顆石藻的培養(yǎng)方法，采用可提高赫氏顆石藻生物量，又可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺積累的培養(yǎng)基組合物，該培養(yǎng)基可使赫氏顆石藻達(dá)到高密度培養(yǎng)的前提下，藻體品質(zhì)與自養(yǎng)培養(yǎng)相比有較大幅度提高。
[0007]本發(fā)明的另一目的是提供一種赫氏顆石藻神經(jīng)酰胺的制備方法。
[0008]本發(fā)明所采用的第一技術(shù)方案是，一種用于培養(yǎng)赫氏顆石藻的培養(yǎng)基組合物，包括以下組分:不含 Si 的 f/2 培養(yǎng)基 +11 μM NaFeEDTA+5mM Serine+3mM NaHC03+l% -2.5%的赫氏顆石藻病毒裂解液。
[0009]進(jìn)一步地，不含Si的f/2培養(yǎng)基海水的鹽度為18%。。
[0010]進(jìn)一步地，病毒裂解液的制備方法:將分離自挪威西南海岸的赫氏顆石藻特異性病毒EhV99Bl感染處于對(duì)數(shù)后期的赫氏顆石藻E.huxleyi B0F92 (分離自挪威西南海岸)，待藻培養(yǎng)液被病毒裂解變得清澈透亮(即藻細(xì)胞已被裂解完全)，裂解液用孔徑為0.45 μ m的混合纖維素酯濾膜過(guò)濾，過(guò)濾液用Masterflex I/P Easy-Load婦動(dòng)栗以5mL/min的流速栗進(jìn)，經(jīng)Millipore pellicon卷式膜包(其截留分子量為30kDa)切向流超濾濃縮后(此過(guò)程中控制回流速度為0.5mL/min)，獲得病毒裂解濃縮液和病毒裂解收集液(其中病毒裂解收集液中不含病毒顆粒)。
[0011]本發(fā)明所采用的第二技術(shù)方案是，一種赫氏顆石藻的培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
[0012]1)、制備用于培養(yǎng)赫氏顆石藻的培養(yǎng)基組合物；
[0013]2)、將赫氏顆石藻按4.5X105cells/mL的密度接種于用于培養(yǎng)赫氏顆石藻的培養(yǎng)基組合物上；
[0014]3)、培養(yǎng)體積為50mL，在18?20°C，光照強(qiáng)度為15?25 μ mol.m 2.s \光照時(shí)間為12L: 12D的條件下靜止培養(yǎng)赫氏顆石藻，每天攪拌或者搖瓶1?2次；以接種的時(shí)間算起，隔天取樣一次，并在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用公式μ zLnWt-Nj/t，其中，隊(duì)為經(jīng)過(guò)t時(shí)間培養(yǎng)后單位體積的藻細(xì)胞數(shù)；N。為t時(shí)間培養(yǎng)初始單位體積藻細(xì)胞數(shù)；t為培養(yǎng)的時(shí)間；μ為赫氏顆石藻的每天平均生長(zhǎng)率，以檢測(cè)添加培養(yǎng)組合物后赫氏顆石藻的生長(zhǎng)。
[0015]進(jìn)一步地，用于培養(yǎng)赫氏顆石藻的培養(yǎng)基組合物為:不含Si的f/2培養(yǎng)基+11 μ ΜNaFeEDTA+5mM Serine+3mM NaHC03+l% _2.5%的赫氏顆石藻病毒裂解液。
[0016]進(jìn)一步地，赫氏顆石藻病毒裂解液通過(guò)以下方法制備得到:將赫氏顆石藻特異性病毒感染處于對(duì)數(shù)后期的赫氏顆石藻，待藻培養(yǎng)液被病毒裂解變得清澈透亮，即藻細(xì)胞已被裂解完全時(shí)，將裂解液用孔徑為0.45 μ m的混合纖維素酯濾膜過(guò)濾，將過(guò)濾液用蠕動(dòng)栗以5mL/min的流速栗進(jìn)，經(jīng)卷式