一種土壤有益微生物混合發(fā)酵的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物肥料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種土壤有益菌株淡紫擬青霉、東方 伊薩酵母、地衣芽孢桿菌混合發(fā)酵的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著農(nóng)業(yè)集約化發(fā)展、政策的支持以及人們對綠色有機產(chǎn)品的訴求，現(xiàn)代農(nóng)業(yè)迅 速發(fā)展的同時也遇到了許多棘手的問題，諸如土壤板結(jié)、土傳病害嚴重、連作障礙、作物品 質(zhì)下降等。大量的化肥農(nóng)藥施入土壤，影響了生態(tài)環(huán)境和人類健康，而微生物產(chǎn)品正是解決 這些問題的必由之路，尤其是在人類面臨能源危機、資源緊缺、環(huán)境污染等背景下（李俊， 2006)。微生物產(chǎn)品在培肥地力，提高化肥利用率，抑制農(nóng)作物對硝態(tài)氮、重金屬、農(nóng)藥的吸 收，凈化和修復(fù)土壤，降低農(nóng)作物病害發(fā)生，以及提高農(nóng)作物產(chǎn)品品質(zhì)和食品安全等方面表 現(xiàn)出了不可替代的作用（葛成，2007)。
[0003] 許多重要的生化過程靠單種微生物是不能完成或只能微弱進行（林靜，2004)。復(fù) 合微生物制劑含有多種有益微生物菌群，有效菌群可在植物根際優(yōu)勢繁殖，改善了植物根 際微生態(tài)環(huán)境，其代謝產(chǎn)物及分泌物能刺激作物生長，提高對土壤養(yǎng)分的吸收能力（李阜 棣，1996)。單菌株由于其代謝類型、呼吸類型及作用功能單一，對環(huán)境適應(yīng)能力弱，很難在 土壤中成為優(yōu)勢菌群。而混合有益菌由于菌群組成多樣，具有對環(huán)境適應(yīng)能力強，應(yīng)用范圍 廣，促生增產(chǎn)效果明顯等優(yōu)點。因此，利用微生物之間的協(xié)同作用，構(gòu)建多菌型微生物制劑 是生物肥料行業(yè)研究的熱點。
[0004] 土壤有益微生物淡紫擬青霉能夠產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶和絲氨酸蛋白酶，在植物線蟲 病、有害昆蟲、植物病原菌的防治等方面均有特別的功效（李芳，2004 ;AlvareZ，2000)。 Bakalivan〇v(1966)發(fā)現(xiàn)，淡紫擬青霉可以產(chǎn)生吲哚乙酸，具有促生增產(chǎn)的作用。地衣芽孢 桿菌能夠促進土壤中有機物腐殖化，增強土壤肥效，改善土壤板結(jié)，提高土壤保溫、蓄水和 蓄能性能，抑制病原菌繁殖，降低植物病害等，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)部登記的微生物肥料產(chǎn)品中 (胡云廣，2011)。東方伊薩酵母（Kurtzman等人在2008年提出將伊薩酵母歸入畢赤酵母， Issatchenkia orientalis東方伊薩酵母，名稱已變更為Pichia kudriavzevii庫德里阿茲 威畢赤酵母）可作為生防制劑用于拮抗果蔬采后病菌（林曉敏，2015)。相關(guān)研究表明，淡 紫擬青霉和地衣芽孢桿菌單獨和有機肥復(fù)配均具有抗病促生效果（劉會清，2011)。中國專 利201010540183. 8公開了一種速效多菌種微生物復(fù)合沖施肥及其制備方法，添加有酵母 菌、地衣芽孢桿菌等土壤益生菌，但其制備方法為各菌株單獨發(fā)酵后按比例混合。中國專利 201410617387. 5公開了一種用于種植水稻和玉米的微生物菌粉，添加的有益微生物涉及到 地衣芽孢桿菌和酵母菌等，但對于發(fā)酵工藝沒有特別的說明。中國專利200910038426. 5公 開了一種多功能生物復(fù)混肥、其制備方法和應(yīng)用，添加的有益微生物涉及到三種芽孢桿菌， 采用傳統(tǒng)單獨液體發(fā)酵的形式。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種淡紫擬青霉、東方伊薩酵母、地衣芽孢桿菌混合發(fā)酵的 方法及其應(yīng)用。
[0006] 方法的步驟為：
[0007] 1)分別在活化菌株淡紫擬青霉、東方伊薩酵母、地衣芽孢桿菌，將活化好的三株菌 轉(zhuǎn)接到相應(yīng)的液體培養(yǎng)基上制備種子液。
[0008] 其中，淡紫擬青霉（Paecilomyces lilacinus)優(yōu)選為三炬03號菌株、保藏機構(gòu)： 中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地點：湖北省武漢市，.武漢大學(xué)；保藏時間2010年6月30 日，保藏編號 CCTCC N0:2010165 ;
[0009] 東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis)優(yōu)選三炬-06菌株，保藏機構(gòu)：中國典 型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地點：湖北省武漢市，.武漢大學(xué)；保藏時間2012年11月21日；保 藏編號 CCTCC NO :2012470
[0010] 地衣芽孢桿菌（Bacillus lincheniformis)優(yōu)選三炬-10菌株，保藏機構(gòu)：中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地點，北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號， 中國科學(xué)院微生物研究所，保藏時間2015年4月24日；保藏編號為CGMCC No. 10741。
[0011] 淡紫擬青霉、東方伊薩酵母、地衣芽孢桿菌分別優(yōu)選采用PDA、YPD以及營養(yǎng)瓊脂 培養(yǎng)基活化。其中：
[0012] PDA培養(yǎng)基成分為：馬鈴薯200g/L、葡萄糖20g/L、瓊脂20g/L，自然pH ;ΥΗ)培養(yǎng)基 成分為：酵母膏l(xiāng)〇g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L、瓊脂20g/L，自然pH ;營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 成分為：蛋白胨l〇g/L、牛肉膏3g/L、氯化鈉5g/L、瓊脂20g/L，自然pH。
[0013] 淡紫擬青霉經(jīng)接種后，培養(yǎng)4~6d收集孢子，用生理鹽水洗滌孢子制備孢子懸液， 用無菌水調(diào)節(jié)孢子懸液至〇D6。。為0. 2,以10%的接種量將孢子懸液接種到液體培養(yǎng)基中， 28°C、180rpm培養(yǎng)2d，制得淡紫擬青霉種子液，經(jīng)稀釋涂板計數(shù)與0D_值的測量，得出淡 紫擬青霉種子液有效活菌數(shù)（億/mL)與0D6。。值之間的關(guān)系為：y = 0. 3386X-0. 0318, R 2 = 0.9803。
[0014] 東方伊薩酵母經(jīng)過接種后，培養(yǎng)1~2d從斜面刮取一環(huán)菌體于裝有生理鹽水的三 角瓶，搖勻稀釋，測得〇D6。。為0. 2,以10%的接種量接于10mL的液體培養(yǎng)基28°C、160rpm培 養(yǎng)2d，制備東方伊薩酵母種子液，經(jīng)稀釋涂板計數(shù)與0D_值的測量，得出東方伊薩酵母種 子液有效活菌數(shù)（億/mL)與0D6。。值之間的關(guān)系為：y = 0. 6703X-0. 0717, R2= 0. 9927。
[0015] 地衣芽孢桿菌經(jīng)過接種后，培養(yǎng)2~3d從斜面刮取一環(huán)菌體于裝有生理鹽水的三 角瓶，搖勻稀釋，測得〇D6。。為0. 2,以10%的接種量接于10mL的液體培養(yǎng)基30°C、160rpm培 養(yǎng)2d，制備地衣芽孢桿菌種子液，經(jīng)稀釋涂板計數(shù)與0D_值的測量，得出地衣芽孢桿菌種 子液有效活菌數(shù)（億/mL)與0D6。。值之間的關(guān)系為：y = 2. 1695X-0. 0659, R2= 0. 9976。
[0016] 2)三株菌分別以5-20%的接種量接種至混合發(fā)酵培養(yǎng)基中，根據(jù)種子液有效活 菌數(shù)與0D6。。值之間的關(guān)系，控制地衣芽孢桿菌比其他兩株菌的有效活菌數(shù)高一個數(shù)量級。 優(yōu)選地，地衣芽孢桿菌接種量為0. 1-0. 5億個/ml發(fā)酵液，其它兩株菌分別為0. 01-0. 05億 個/ml發(fā)酵液。培養(yǎng)基成分為：蔗糖10~20g/L、大豆粉10~20g/L、磷酸二氫鉀1~3g/ L、微量元素0~0.5g/L，起始pH值6. 2-6.8。其中微量元素為氯化鈣或硫酸鋅或不加。培 養(yǎng)基成分最優(yōu)為：蔗糖15g/L、大豆粉10g/L、磷酸二氫鉀lg/L、氯化鈣0. lg/L，起始pH值 6. 5〇
[0017] 3) 28°C、180rpm 混合發(fā)酵 3d。
[0018] 目前，還沒有文獻報道淡紫擬青霉、東方伊薩酵母、地衣芽孢桿菌混合發(fā)酵的方 法。不同屬的微生物培養(yǎng)所需的營養(yǎng)物質(zhì)不盡相同，同時培養(yǎng)容易產(chǎn)生拮抗作用。除了考 慮不同種屬微生物生長繁殖所需的碳源、氮源、無機元素、微量元素、水和氧氣等。對于大規(guī) 模發(fā)酵生產(chǎn)，還須重視培養(yǎng)基原料的價格和來源。傳統(tǒng)做法是將不同菌株在各自不同的生 長環(huán)境中活化、逐級發(fā)酵后離心收集菌體，將各發(fā)酵產(chǎn)物混合制成多菌混合產(chǎn)品，具有制備 工藝復(fù)雜，成本高，應(yīng)用受到限制等缺點。
[0019] 本發(fā)明的優(yōu)點是，將三種土壤有益菌株淡紫擬青霉、東方伊薩酵母、地衣芽孢桿菌 混合發(fā)酵，發(fā)酵方法簡易高效，發(fā)酵過程中發(fā)酵液的pH比較穩(wěn)定；三種菌株能夠相互協(xié)同 又不產(chǎn)生拮抗作用，在培養(yǎng)基中生長良好，發(fā)酵3d后各功能菌有效活菌數(shù)多2億/mL;混 合發(fā)酵培養(yǎng)基配方簡單，降低了生產(chǎn)成本，提高了設(shè)備利用率，適宜于發(fā)酵產(chǎn)品的規(guī)?；?產(chǎn)；混合發(fā)酵菌劑具有改善土壤菌群平衡，減少化肥農(nóng)藥施用的作用；混合發(fā)酵菌劑使用 安全，對環(huán)境無污染。
[0020] 三種菌的混菌發(fā)酵方法，一方面為發(fā)酵產(chǎn)品的規(guī)?；a(chǎn)提供了方法，另一方面， 發(fā)酵產(chǎn)品可以和有機物料（腐熟的畜禽糞便、沼渣、蔗渣、泥炭、秸桿等）復(fù)配生產(chǎn)生物有機 肥以及和微量