，倒置顯微鏡下觀察，最后輕輕吹打上述原生質(zhì)體，使其分布均 勻，用移液槍吸取一滴在血球計數(shù)板上，蓋上蓋玻片，置于倒置顯微鏡下計數(shù)，連續(xù)計數(shù)三 次，取平均值；根據(jù)加入酶溶液中葉片的多少計算出每克葉片得到的原生質(zhì)體產(chǎn)量，計算結(jié) 果以每克葉片原生質(zhì)體數(shù)表示（個/g)。
[0047] 酶解液的配制：纖維素酶15g/L，半纖維素酶10g/L，果膠酶10g/L，離析酶3g/L，甘 露醇 70g/L，10mM 的 MES 100ml/L，PH 為 5-6。
[0048] 洗液的配制：甘露醇70g/L，10mM的MES 100ml/L等體積混合，PH為5-6。
[0049] 結(jié)果：原生質(zhì)體產(chǎn)量為8. 43 X 104個/g，見表1，純度高，質(zhì)膜完整，受損小，狀態(tài) 好，最終得到污染少，產(chǎn)量大，純度高，比較理想的原生質(zhì)體。見圖5。
[0050] 實(shí)施例4 :一種快速獲得鹽生草葉片原生質(zhì)體的方法，取2個月盆栽苗的葉片，用 蒸餾水沖洗三次，濾紙將其表面擦干，沿主脈縱切，然后在25°C，黑暗條件下酶解2h后，在 培養(yǎng)皿中加入等體積的洗液，接著在黑暗條件下，放入25°C，30rpm的水平搖床lOmin,再 用5ml的移液槍將酶解液吸入10ml的試管，并將其放入25°C的離心機(jī)2350r離心10min， 用移液槍吸取4ml的上清液，倒置顯微鏡下觀察，最后輕輕吹打上述原生質(zhì)體，使其分布均 勻，用移液槍吸取一滴在血球計數(shù)板上，蓋上蓋玻片，置于倒置顯微鏡下計數(shù)，連續(xù)計數(shù)三 次，取平均值；根據(jù)加入酶溶液中葉片的多少計算出每克葉片得到的原生質(zhì)體產(chǎn)量，計算結(jié) 果以每克葉片原生質(zhì)體數(shù)表示（個/g)。
[0051] 酶解液的配制：纖維素酶10_30g/L，半纖維素酶20g/L，果膠酶20g/L，離析酶5g/ L，甘露醇 85g/L，10mM 的 MES150ml/L，PH 為 5-6。
[0052] 洗液的配制：甘露醇85g/L，10mM的MES150ml/L等體積混合，PH為5-6。
[0053] 結(jié)果：原生質(zhì)體產(chǎn)量為8.40 X 104個/g，見表1，純度高，質(zhì)膜完整，受損少，狀態(tài) 好，最終得到污染少，產(chǎn)量大，純度高，比較理想的原生質(zhì)體。見圖6。
[0054] 表1鹽生草葉片原生質(zhì)體產(chǎn)量
[0055]
[0056] 注：小寫字母a表示處理間差異水平不顯著（p〈0. 05)。
[0057] 試驗(yàn)例：快速獲得鹽生草葉片原生質(zhì)體的方法
[0058] 在制備與純化原生質(zhì)體的過程中，細(xì)胞的獲得方式，酶解的時間以及離心率起到 了關(guān)鍵作用，本試驗(yàn)通過對上述三種關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化，確定了最佳的制備和純化鹽生草 葉片原生質(zhì)體的方法。
[0059] 1最佳鹽生草葉片細(xì)胞獲得方式的選擇
[0060] 采用2種方式獲得單細(xì)胞，第一種是通過培養(yǎng)無菌實(shí)生苗葉片來誘導(dǎo)愈傷組織， 然后通過愈傷組織懸浮培養(yǎng)得到單細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)，接著將上述單細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)酶解2. 30h， 最后在倒置顯微鏡下觀察，無菌苗培養(yǎng)基主要由1/2 Hoagland營養(yǎng)液，6g/L的瓊脂粉組 成，PH = 5. 7,誘導(dǎo)愈傷組織所用培養(yǎng)基主要由MS營養(yǎng)液+2. Omg/L 2, 4-D(2, 4-二氯苯氧 乙酸）+6g/L瓊脂+30g/L蔗糖組成，PH = 5. 7。細(xì)胞懸浮培養(yǎng)所用培養(yǎng)基主要由MS營養(yǎng)液 +0· 25g/L 酪蛋白 +0· 5g/L PVP+2. Omg/L 2, 4-D (2, 4-二氯苯氧乙酸）+30g/L 蔗糖組成，PH =5. 7,所用的酶解液為纖維素酶20g/L，半纖維素酶10g/L，果膠酶10g/L，離析酶4g/L，甘 露醇 72. 86g/L，10mM 的 MES 100ml/L，PH 為 5. 5。
[0061] 第二種是用生長1-3個月的盆栽苗，取其靠近植株基部顏色深綠，肉質(zhì)化嚴(yán)重的 葉片，蒸餾水沖洗三次，濾紙擦干后，沿其主脈縱切，然后迅速地放入盛有酶解液的玻璃培 養(yǎng)皿中，酶解2. 30h，最后在倒置顯微鏡下觀察，所用的酶解液為纖維素酶20g/L，半纖維素 酶 10g/L，果膠酶 10g/L，離析酶 4g/L，甘露醇 72. 86g/L，10mM 的 MES 100ml/L，PH 為 5. 5。
[0062] 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：第一種方式獲得的原生質(zhì)體量少，細(xì)胞畸形，雜質(zhì)較多，并污染較嚴(yán)重， 很難通過離心純化原生質(zhì)體。第二種方式得到的原生質(zhì)體產(chǎn)量大，雜質(zhì)少，狀態(tài)好，無污染， 通過離心可以得到比較理想的原生質(zhì)體。
[0063] 2最適酶解時間的選擇
[0064] 通過實(shí)驗(yàn)1優(yōu)選出的最佳原生質(zhì)體獲得的基礎(chǔ)上，對酶解時間進(jìn)行研究，設(shè)置三 個處理，分別是處理A :酶解1. 30h，處理B :酶解2. 30h，處理C :酶解4h。將生長1-3個月 的盆栽苗，取其靠近植株基部顏色深綠，肉質(zhì)化嚴(yán)重的葉片，蒸餾水沖洗三次，濾紙擦干后， 沿其主脈縱切，然后迅速地放入盛有酶解液的玻璃培養(yǎng)皿中，酶解時間為A，B，C，最后在倒 置顯微鏡下觀察。
[0065] 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：處理A和處理C得到的原生質(zhì)體產(chǎn)量較少，處理B可得到大量較理想的 原生質(zhì)體。
[0066] 3最適離心率的選擇
[0067] 通過實(shí)驗(yàn)2選擇出最佳酶解時間的基礎(chǔ)上，對離心率進(jìn)行了選擇，設(shè)置三個處理， 分別是處理A :1500r，處理B :2500r，處理C :4000r，將生長1-3個月的盆栽苗，取其靠近 植株基部顏色深綠，肉質(zhì)化嚴(yán)重的葉片，蒸餾水沖洗三次，濾紙擦干后，沿其主脈縱切，然后 迅速地放入盛有酶解液的玻璃培養(yǎng)皿中，酶解2. 30h，然后在培養(yǎng)皿中加入等體積的洗液， 接著在黑暗條件下，放入25°C，30rpm的水平搖床12min，再用5ml的移液槍將酶解液吸入 l〇ml的試管，并將其放入25°C的離心機(jī)離心10min,轉(zhuǎn)速為處理A，處理B，處理C，最后用移 液槍吸取4ml的上清液，倒置顯微鏡下觀察。
[0068] 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：處理A試管上面4ml的溶液中原生質(zhì)體較少，下面6ml溶液原生質(zhì)體量 多，但雜質(zhì)很多，處理C試管上面4ml的溶液和下面6ml溶液原生質(zhì)體產(chǎn)量少且雜質(zhì)較多， 原生質(zhì)體有破碎的現(xiàn)象，處理B試管上面4ml的溶液中原生質(zhì)體產(chǎn)量多，并且雜質(zhì)少，下面 6ml的溶液中原生質(zhì)體產(chǎn)量少，雜質(zhì)多。因此處理B試管上面4ml的溶液中原生質(zhì)體是較理 想的原生質(zhì)體。
[0069] 上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種快速獲得鹽生草葉片原生質(zhì)體的方法，其特征在于步驟為： (1) 幼苗的種植，選取飽滿的鹽生草種子3-5月種植于花盆，其蛭石與沙子體積比為 1:1-3:1 ； (2) 葉片的選取，待步驟（1)獲得的幼苗長至1-3個月，用刀片切取靠近植株基部2/3 處的葉片，蒸餾水沖洗三次，待用； (3) 原生質(zhì)體的獲得，將步驟（2)獲得的葉片用濾紙擦干，用刀片沿葉片主脈縱切，然 后放入酶解液中，22-25°C，黑暗條件下酶解2-3h; (4) 原生質(zhì)體的純化，在步驟（3)酶解后的酶解液中加入等體積的洗液，放置在黑暗條 件下，22-25°C，25-40rpm的水平搖床10-15min，然后用5ml的移液槍將酶解液吸入10ml的 試管，接著將其放入22-25°C的離心機(jī)2000-3000r離心8-10min，最后用移液槍吸取4-5ml 的上清液，即為純的原生質(zhì)體； (5) 原生質(zhì)體產(chǎn)量的測定，吹打步驟（4)所述原生質(zhì)體，使其分布均勻，用移液槍吸取 一滴在血球計數(shù)板上，蓋上蓋玻片，置于倒置顯微鏡下計數(shù)，連續(xù)計數(shù)三次，取平均值；根據(jù) 加入酶溶液中葉片的多少計算出每克葉片得到的原生質(zhì)體產(chǎn)量，計算結(jié)果以每克葉片原生 質(zhì)體數(shù)表示個/g。2. 如權(quán)利要求1所述的快速獲得鹽生草葉片原生質(zhì)體的方法，其特征在于步驟（1)所 述的幼苗在自然條件下生長，蛭石與沙子120-180°C滅菌4-6h，并每隔3-5d噴灑一次1/2 Hoagland-Hoagland營養(yǎng)液。3. 如權(quán)利要求1所述的快速獲得鹽生草葉片原生質(zhì)體的方法，其特征在于步驟（2)所 述選取的葉片為靠近植株基部2/3處，顏色深綠，肉質(zhì)化嚴(yán)重，并且在10-30min內(nèi)使用。4. 如權(quán)利要求1所述的快速獲得鹽生草葉片原生質(zhì)體的方法，其特征在于步驟（3) 所述的酶解液的組成：纖維素酶10_30g/L，半纖維素酶5-20g/L，果膠酶5-20g/L，離析酶 2-5g/L，甘露醇60-85g/L，10mM的MES50-150ml/L，等體積混合，PH為5-6 ;所述的步驟（4) 洗液的組成：甘露醇60-85g/L，10mM的MES50-150ml/L等體積混合，PH為5-6。5. 如權(quán)利要求1所述的快速獲得鹽生草葉片原生質(zhì)體的方法，其特征在于步驟（3) 所述的原生質(zhì)體的獲得，在制備原生質(zhì)體時，清洗后葉片表面用濾紙擦干，然后用刀片在 10-30min內(nèi)沿主脈縱切，接著用鑷子撥入盛有酶解液的玻璃培養(yǎng)皿中，酶解液用超純水配 制，調(diào)PH用K0H或HC1。6. 如權(quán)利要求1所述的快速獲得鹽生草葉片原生質(zhì)體的方法，其特征在于步驟（4)所 述的純化原生質(zhì)體時，用l〇ml的圓底塑料試管以及水平轉(zhuǎn)子的離心機(jī)，2000-3000r離心 8-10min，離心后，將溶液靜止，時間為5-10min，再吸取4-5ml的上清液，最后在倒置顯微鏡 下觀察原生質(zhì)體的情況。7. 如權(quán)利要求1所述的快速獲得鹽生草葉片原生質(zhì)體的方法，其特征在于步驟（5)所 述原生質(zhì)體直徑為10um-150um之間，原生質(zhì)體共存于洗液當(dāng)中。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種鹽生草原生質(zhì)體的制備及純化的方法，它包括以下步驟：1.幼苗的種植；2.葉片的選取；3.原生質(zhì)體的獲得，用刀片沿其主脈縱切，然后放入酶解液中；4.原生質(zhì)體的純化，酶解后，加入等體積的洗液，最后用移液槍吸取4-5ml的上清液，即為較純的原生質(zhì)體；5.原生質(zhì)體產(chǎn)量的測定，根據(jù)加入酶溶液中葉片的多少計算出每克葉片得到的原生質(zhì)體產(chǎn)量，計算結(jié)果以每克葉片原生質(zhì)體數(shù)表示(個/g)。本發(fā)明簡單易行，獲得的原生質(zhì)體純度高，數(shù)量可達(dá)8.4×104個/g,也可避免組培污染，能為體細(xì)胞的雜交，各種細(xì)胞器(如細(xì)胞核，葉綠體，線粒體，液泡等)的分離，生物反應(yīng)器的構(gòu)建以及原生質(zhì)體融合育種等奠定基礎(chǔ)。
【IPC分類】C12N5/04
【公開號】CN105316276
【申請?zhí)枴緾N201510894100
【發(fā)明人】姚立蓉, 王化俊, 汪軍成, 孟亞雄, 李葆春, 馬小樂, 楊柯, 賴勇, 司二靜, 任盼榮, 李吉睿
【申請人】甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2016年2月10日
【申請日】2015年11月27日