一種提高類芽孢桿菌產(chǎn)糖量的選育方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提高類芽孢桿菌產(chǎn)糖量的選育方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]微生物絮凝劑是利用生物技術(shù)，從微生物體或其分泌物中富集、篩選、純化而獲得的一種安全、易生物降解的新型水處理絮凝劑，微生物絮凝劑作為一種天然的絮凝劑，它在確保應(yīng)用安全性的前提下還具有光譜絮凝活性，這為其在與人體健康密切關(guān)系的給水排水處理、食品加工和發(fā)酵工業(yè)等方而提供了廣闊的應(yīng)用前景。
[0003]隨著工業(yè)廢水的大量排放，水體污染日益加重，水環(huán)境問題引起了廣泛的關(guān)注。絮凝沉淀是目前國(guó)內(nèi)外普遍采用的一種水處理方法。而絮凝劑是沉降水處理過程的核心，在其中起著至關(guān)重要的作用。由于微生物絮凝劑具有絮凝范圍廣泛、高效、無毒、無二次污染等優(yōu)點(diǎn)，使得近年來對(duì)微生物絮凝劑的研究取得了很大的進(jìn)步。但是于此同時(shí)，仍有缺乏理論指導(dǎo)、制備成本高、難于大規(guī)模生產(chǎn)等問題迫切需要解決。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的一些問題，本發(fā)明提供一種提高類芽孢桿菌產(chǎn)糖量的選育方法及其應(yīng)用，所述選育方法是利用等離子體誘變技術(shù)對(duì)高產(chǎn)微生物絮凝劑的類芽孢桿菌進(jìn)行誘變育種，提高了其絮凝效率和絮凝劑產(chǎn)量。本發(fā)明采用的類芽孢桿菌型號(hào)為A9，已在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，建議分類命名為:類芽孢桿菌Paenibacillus sp.，保藏編號(hào)為:CGMCC2040，保藏日期為:2007年5月11日，地址:中國(guó).北京.朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)；本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
一種提高類芽孢桿菌產(chǎn)糖量的選育方法，按照以下工藝步驟進(jìn)行:
(1)將類芽孢桿菌出發(fā)菌株接種到普通液體培養(yǎng)基中，活化20~32h;
(2)將活化的菌液離心，棄去上清液，沉淀菌體用無菌生理鹽水稀釋成濃度為100000~150000cfu/ml 的菌懸液；
(3 )取步驟(2 )的菌懸液15~20uL制成菌膜，利用多功能等離子體誘變系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行誘變；
(4)取誘變后的菌體加入無菌生理鹽水稀釋至lmL，取0.lmL均勻涂布于普通固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)36~48h ；
(5)根據(jù)菌落形態(tài)大小，初步篩選出等離子體誘變平板上與出發(fā)菌株形態(tài)相似、菌落半徑較大的初篩菌株；
(6)將類芽孢桿菌初篩菌株接種于普通液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20~32h，得到產(chǎn)糖量較高的類芽孢桿菌菌株；
(7)將步驟(6)的菌懸液以1%的接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24~72h;離心，分離，保留上清液，利用醇沉-冷凍干燥法得到的粗多糖即為絮凝劑，稱量粗多糖重量，確定步驟(6)得到的為產(chǎn)糖量較高的類芽孢桿菌菌株；
(8)將步驟(6)的產(chǎn)糖量較高的類芽孢桿菌菌株接種于普通液體培養(yǎng)基中，重復(fù)步驟
(6)和(7)的過程5~8次，確定其產(chǎn)糖量的遺傳穩(wěn)定性。
[0005]所述類芽孢桿菌出發(fā)菌株由從果樹根系土壤分離篩選純化獲得。
[0006]所述普通液體培養(yǎng)基的化學(xué)成分及濃度為:牛肉膏5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，蒸饋水1L/L。
[0007]所述普通固體培養(yǎng)基的化學(xué)成分及濃度為:牛肉膏5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，氯化鈉 5.0 g/L，瓊脂 15.0-20.0 g/L，蒸餾水 1L/L。
[0008]所述發(fā)酵培養(yǎng)基的化學(xué)成分及濃度為:葡萄糖20.0g/L，磷酸二氫鉀2.0g/L，磷酸氫二鉀5.0g/L,七水硫酸鎂0.2g/L，氯化鈉0.lg/L，脲0.5g/L，酵母膏0.5g/L，蒸饋水1L/L。
[0009]所述活化過程的條件為:溫度25~30°C，pH6.5-7.5，搖床轉(zhuǎn)速130~160r/min。
[0010]所述培養(yǎng)過程的條件為:溫度25~30°C，pH6.5-7.5。
[0011]所述離心過程的條件為:轉(zhuǎn)速8000~10000 r/min，時(shí)間10~30min。
[0012]所述誘變過程的條件為:電源功率為300W，工作氣流為12L/min，等離子體發(fā)射源與樣品之間的高度為5_，工作氣體為氮?dú)?，照射時(shí)間為105~110s。
[0013]所述發(fā)酵過程的條件為:溫度25~30°C，pH 7~8，搖床轉(zhuǎn)速130~160r/min。
[0014]所述一種提高類芽孢桿菌產(chǎn)糖量的選育方法應(yīng)用于粉煤灰廢水、水體中微藻的沉降處理；所述應(yīng)用較佳地為對(duì)濃度為1~10 g/L、粉煤灰粒徑大小為0.050-0.150mm的粉煤灰廢水、富營(yíng)養(yǎng)化水體和高效藻類塘中微藻的沉降處理，絮凝率達(dá)到85%以上；所述應(yīng)用最佳地為對(duì)水中純培養(yǎng)的念珠藻或顫藻的沉降處理，絮凝率達(dá)到96%以上。
[0015]本發(fā)明的有益效果如下:
本發(fā)明方法利用等離子體誘變技術(shù)對(duì)高產(chǎn)微生物絮凝劑的類芽孢桿菌進(jìn)行誘變育種，有效提高了類芽孢桿菌的絮凝效率和絮凝劑產(chǎn)量，不但能為微生物絮凝劑的理論研究提供參考，拓寬對(duì)生物絮凝劑組成及合成、純化等方面的認(rèn)識(shí)領(lǐng)域，還能為微生物絮凝劑的產(chǎn)業(yè)化提供技術(shù)保證。此外，將本發(fā)明方法獲得的產(chǎn)糖量較高的類芽孢桿菌菌株應(yīng)用于粉煤灰廢水、水體中微藻的沉降處理，對(duì)濃度為1~10 g/L，粉煤灰粒徑大小為0.050-0.150mm的粉煤灰廢水、富營(yíng)養(yǎng)化水體和高效藻類塘中微藻的沉降處理效果較佳，絮凝率達(dá)到85%以上；對(duì)水中純培養(yǎng)的念珠藻或顫藻的沉降處理最佳，絮凝率達(dá)到96%以上。
【具體實(shí)施方式】
[0016]本發(fā)明實(shí)施采用的類芽孢桿菌型號(hào)為A9，已在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，建議分類命名為:類芽孢桿菌Paenibacillus sp.，保藏編號(hào)為:CGMCC2040，保藏日期為:2007年5月11日，地址:中國(guó).北京.朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。該類芽孢桿菌由從果樹根系土壤分離篩選純化獲得。
[0017]本發(fā)明實(shí)施誘變過程采用的多功能等離子體誘變器型號(hào)為:MPMS_MANDELA。
[0018]本發(fā)明實(shí)施稀釋過程采用的震蕩器型號(hào)為:K133。
[0019]本發(fā)明實(shí)施離心過程采用的高速臺(tái)式離心機(jī)型號(hào)為:LG16_A。
[0020]本發(fā)明實(shí)施醇沉-冷凍干燥法采用的真空干燥箱型號(hào)為:D2F_6050。
[0021]本發(fā)明實(shí)施采用的高效藻類塘水來自沈陽(yáng)市多家污水處理廠經(jīng)二級(jí)處理后的生活污水。
[0022]本發(fā)明實(shí)施采用的富營(yíng)養(yǎng)化水來自沈陽(yáng)市不同區(qū)域的景觀水體。
[0023]實(shí)施例1
提高類芽孢桿菌產(chǎn)糖量的選育方法及其應(yīng)用于濃度為4g/L，粉煤灰粒徑為
0.050-0.074mm的粉煤灰廢水的沉降處理，按照以下工藝步驟進(jìn)行:
(1)將類芽孢桿菌出發(fā)菌株接種到普通液體培養(yǎng)基中，在溫度為25~30°C，pH為7.0，搖床轉(zhuǎn)速為140r/min的條件下活化20h ；
(2)將活化的菌液在轉(zhuǎn)速為8000r/min的條件下離心15min，棄去上清液，沉淀菌體用無菌生理鹽水稀釋成濃度為100000cfu/ml的菌懸液；
(3 )取步驟(2 )的菌懸液15uL制成菌膜，利用多功能等離子體誘變系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行誘變，誘變條件為:電源功率為300W，工作氣流為12L/min，等離子體發(fā)射源與樣品之間的高度為5mm，工作氣體為氮?dú)?，照射時(shí)間為108s ;
(4)取誘變后的菌體加入無菌生理鹽水稀釋至lmL，取0.lmL均勻涂布于普通固體培養(yǎng)基中，在溫度為25~30°C，pH為7.0的條件下培養(yǎng)48h ;
(5)根據(jù)菌落形態(tài)大小，初步篩選出等離子體誘變平板上與出發(fā)菌株形態(tài)相似、菌落半徑較大的初篩菌株；
(6)將類芽孢桿菌初篩菌株接種于普通液體培養(yǎng)基中，在溫度為25~30°C，pH為7.0的條件下培養(yǎng)24h，得到產(chǎn)糖量較高的類芽孢桿菌菌株；
(7)將步驟(6)的菌懸液以1%的接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵液體培養(yǎng)基中，在溫度為25~30°C，pH為7.0的條件下培養(yǎng)48h ;在轉(zhuǎn)速為8000r/min的條件下離心15min，分離，保留上清液，利用醇沉-冷凍干燥法得到的粗多糖即為絮凝劑，稱量產(chǎn)糖量較高菌株的粗多糖重量為
1.79mg/mL，比出發(fā)菌株高出14.7% ；
(8 )將步驟(6 )的產(chǎn)糖量較高的菌株接種于普通液體培養(yǎng)基中，重復(fù)步驟(6 )和(7 )的過程5次，最終所得菌株的粗多糖產(chǎn)量為1.79±0.02mg/mL，遺傳穩(wěn)定性較好；
(9)將步驟(6)的產(chǎn)糖量較高的菌株用于4g/L粉煤灰廢水的沉降處理，絮凝率為86.19%，效果較佳。
[0024]實(shí)施例2
提高類芽孢桿菌產(chǎn)糖量的選育方法及其應(yīng)用于濃度為10g/L，粉煤灰粒徑為
0.074-0.150mm的粉煤灰廢水的沉降處理，按照以下工藝步驟進(jìn)行:
(1)將類芽孢桿菌出發(fā)菌株接種到普通液體培養(yǎng)基中，在溫度為25~30°C，pH為6.55，搖床轉(zhuǎn)速為130r/min的條件下活化30h ；
(2)將活化的菌液在轉(zhuǎn)速為9000r/min的條件下離心lOmin，棄去上清液，沉淀菌體用無菌生理鹽水稀釋成濃度為100000cfu/ml的菌懸液；
(3 )取步驟(2 )的菌懸液20uL制成菌膜，利用多功能等離子體誘變系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行誘變，誘變條件為:電源功率為300W，工作氣流為12L/min，等離子體發(fā)射源與樣品之間的高度為5mm，工作氣體為氮?dú)?，照射時(shí)間為108s ;
(4)取誘變后的菌體加入無菌生理鹽水稀釋至lmL，取0.lmL均勻涂布于普通固體培養(yǎng)基中，在溫度為25~30°C，pH為6.5的條件下培養(yǎng)48h ; (5)根據(jù)菌落形態(tài)大小，初步篩選出等離子體誘變平板上與出發(fā)菌株形態(tài)相似、菌落半徑較大的初篩菌株；
(6)將類芽孢桿菌初篩菌株接種于普通液體培養(yǎng)基中，在溫度為25~30°C，pH為6.5的條件下培養(yǎng)24h，得到產(chǎn)糖量較高的類芽孢桿菌菌株；
(7)將步驟(6)的菌懸液以1%的接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵液體培養(yǎng)基中，在溫度為25~30°C，pH為6.5的條件下培養(yǎng)32h ;在轉(zhuǎn)速為8000r/min的條件下離心15min，分離，保留上清液，利用醇沉-冷凍干燥法得到的粗多糖即為絮凝劑，稱量產(chǎn)糖量較高菌株的粗多糖重量為
1.79mg/mL，比出發(fā)菌株高出14.7% ；
(8 )將步驟(6 )的產(chǎn)糖量較高的菌株接種于普通液體培養(yǎng)基中，重復(fù)步驟(6 )和(7 )的過程6次，最終所得菌株的粗多糖產(chǎn)量為1.79±0.02mg/mL，遺傳穩(wěn)定性較好；
(9)將步驟(6)的產(chǎn)糖量較高的菌株用于4g/L粉煤灰廢水的沉降處理，絮凝率為85.31%，效果較佳。
[0025]實(shí)施例3
提高類芽孢桿菌產(chǎn)糖量的選育方法及其應(yīng)用于水中純培養(yǎng)念珠藻的沉降處理，按照以下工藝步驟進(jìn)行:
(1)將類芽孢桿菌出發(fā)菌株接種到普通液體培養(yǎng)基中，在溫度為25~30°C，pH為7.5，搖床轉(zhuǎn)速為160r/min的條件下活化24h ；
(2)將活化的菌液在轉(zhuǎn)速為8000r/min的條件下離心15min，棄去上清液，沉淀菌體用無菌生理鹽水稀釋成濃度為100000cfu/ml的菌懸液；
(3 )取步驟(2 )的菌懸液15uL制成菌膜，利用多功能等離子體誘變系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行誘變，誘變條件為:電源功率為300W，工作氣流為12L/min，等離子體發(fā)射源與樣品之間的高度為5mm，工作氣體為氮?dú)?，照射時(shí)間為108s ;
(4)取誘變后的菌體加入無菌生理鹽水稀釋至lmL，取0.lmL均勻涂布于普通固體培養(yǎng)基中，在溫度為25~30°C，pH為7.5的條件下培養(yǎng)45h