陸地棉轉(zhuǎn)化事件icr24110及其特異性鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及陸地棉轉(zhuǎn)化事件ICR24110及其特異性鑒定 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 轉(zhuǎn)化事件是由外源基因在基因組插入位點的上下游側(cè)翼區(qū)和外源基因構(gòu)成的分 子結(jié)構(gòu)。通常，外源基因轉(zhuǎn)化植物可以得到一個轉(zhuǎn)化體群體，這個轉(zhuǎn)化體群體包含大量獨立 的事件，其中每個事件都是獨特的。外源基因在植物中的表達受到外源基因所插入的染色 體位置的影響。這可能源自染色質(zhì)結(jié)構(gòu)或者整合位點附近轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的影響。相同基因 在不同轉(zhuǎn)化事件中的表達水平具有很大的差異，在表達的空間或時間模式上也可能存在差 異。而且外源基因的插入也可能會影響內(nèi)源基因的表達。因此，每個獨立轉(zhuǎn)化事件對受體 植物的影響都是不同的。獲得能有效表達外源基因，同時不影響植株本身農(nóng)藝性狀的植物 轉(zhuǎn)化事件在培育轉(zhuǎn)基因作物新品種中具有重要的應(yīng)用價值。
[0003] 棉花作為天然可再生纖維原料，是紡織工業(yè)的重要原料，并在汽車工業(yè)、醫(yī)療產(chǎn)業(yè) 等方面發(fā)揮著重要作用。提高棉花的纖維長度一直以來都是棉花領(lǐng)域的研究重點，一方面 由于棉花纖維是自然界中目前已發(fā)現(xiàn)的最長的細胞，其為研究細胞伸長調(diào)控機制提供了最 佳的實驗材料；另一方由于棉花纖維是單細胞凸起形成的，這為研究細胞命運決定提供了 便利。此外，長纖維是紡織工業(yè)所期望，也是廣大棉花所需要的，因此提高棉花的纖維長度 在生產(chǎn)上具有重要的意義。
[0004] 傳統(tǒng)的育種方法采用雜交來改良棉花的纖維品質(zhì)，海島棉是優(yōu)質(zhì)長纖維的代表棉 花，也是四大栽培品種之一，但由于其產(chǎn)量無法與陸地棉相匹敵，現(xiàn)在在全世界的種植面積 較少，從基因組水平來講海島棉與陸地棉都是異源四倍體，二者之間可以進行種間雜交，但 現(xiàn)有的研究表明二者雜種后代出現(xiàn)了嚴重性狀分離，很難聚合陸地棉產(chǎn)量性狀和海島棉纖 維性狀。棉纖維發(fā)育可分成四個相互交錯的時期：纖維發(fā)育的起始期（開花前1天至開花 后2-3天）、纖維伸長期（開花后3天至25天）、次生壁加厚期（開花后15天至45天）及 成熟期（開花后45天至50天）。對于快速伸長時期的纖維，纖維伸長速率最快可達到2mm/ 天。纖維的長度是纖維的品質(zhì)的首要指標，研究棉纖維發(fā)育的分子機理是棉花遺傳改良的 基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個目的是提供一種轉(zhuǎn)基因棉花的培育方法。
[0006] 本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)基因棉花的培育方法為將外源DNA片段插入目的棉花基 因組第D13號染色體的第56149325-56149356位間，替換掉第D13號染色體的第 56149325-56149356位間30bp的堿基序列，得到轉(zhuǎn)基因棉花；
[0007] 所述轉(zhuǎn)基因棉花的纖維品質(zhì)高于所述目的棉花；
[0008] 所述外源DNA片段為含有GhKCS6基因的DNA分子。
[0009] 上述方法中，
[0010] 所述外源DNA片段的核苷酸序列為序列表中序列1 ;
[0011] 所述外源DNA片段在所述轉(zhuǎn)基因棉花的上游側(cè)翼片段為所述目的棉花基因組第 D13號染色體的自第56149325位核苷酸起向其上游方向延伸得到的長度為0-5Kb的任意一 個DNA片段；
[0012] 所述外源DNA片段在所述轉(zhuǎn)基因棉花的下游側(cè)翼片段為所述目的棉花基因組第 D13號染色體的自第56149356位核苷酸起向其下游方向延伸得到的長度為0-5Kb的任意 一個DNA片段。
[0013] 上述方法中，
[0014] 所述上游側(cè)翼片段為序列表中序列2所示的核苷酸；
[0015] 所述下游側(cè)翼片段為序列表中序列3所示的核苷酸；
[0016] 所述轉(zhuǎn)基因棉花的纖維品質(zhì)高于所述目的棉花體現(xiàn)在如下Bl)-B13):
[0017] B1)轉(zhuǎn)基因棉花纖維的長度高于所述目的棉花；
[0018] B2)轉(zhuǎn)基因棉花纖維的馬克隆值低于所述目的棉花；
[0019] B3)轉(zhuǎn)基因棉花纖維的整齊度高于所述目的棉花；
[0020] B4)轉(zhuǎn)基因棉花纖維的比強度高于所述目的棉花；
[0021] B5)轉(zhuǎn)基因棉花纖維的籽棉產(chǎn)量高于所述目的棉花；
[0022] B6)轉(zhuǎn)基因棉花的株高高于所述目的棉花；
[0023] B7)轉(zhuǎn)基因棉花的葉片長度高于所述目的棉花；
[0024] B8)轉(zhuǎn)基因棉花的葉片寬度高于所述目的棉花；
[0025] B9)轉(zhuǎn)基因棉花的葉柄長度高于所述目的棉花；
[0026] B10)轉(zhuǎn)基因棉花的葉柄寬度高于所述目的棉花。
[0027] B11)轉(zhuǎn)基因棉花的單鈴重高于所述目的棉花；
[0028] B12)轉(zhuǎn)基因棉花的成鈴數(shù)高于所述目的棉花；
[0029] B13)轉(zhuǎn)基因棉花的衣分高于所述目的棉花；
[0030] 所述外源DNA片段通過含有所述外源DNA片段的重組載體導入所述目的棉花；
[0031] 所述目的棉花為陸地棉。
[0032] 上述方法中，
[0033] 所述轉(zhuǎn)基因棉花為轉(zhuǎn)基因棉花ICR24110。
[0034] 本發(fā)明的另一個目的是提供用于檢測或輔助檢測植物樣品是否來源于上述轉(zhuǎn)基 因棉花ICR24110或其后代的方法。
[0035] 本發(fā)明提供的用于檢測或輔助檢測植物樣品是否來源于上述轉(zhuǎn)基因棉花 ICR24110或其后代的方法包括如下步驟：
[0036] 檢測所述植物樣品的基因組DNA中是否含有DNA片段A，
[0037] 所述DNA片段A由上述外源DNA片段在所述轉(zhuǎn)基因棉花ICR24110的上游側(cè)翼片 段、上述外源DNA片段和上述外源DNA片段在所述轉(zhuǎn)基因棉花ICR24110的下游側(cè)翼片段組 成；
[0038] 若所述植物樣品的基因組DNA含有所述DNA片段A，則所述植物樣品為或候選為所 述轉(zhuǎn)基因棉花ICR24110或其后代；
[0039] 若所述植物樣品的基因組DNA不含有所述DNA片段A，則所述植物樣品不為或候選 不為所述轉(zhuǎn)基因棉花ICR24110或其后代。
[0040] 上述方法中，所述方法為如下1)或2)或3):
[0041] 1)直接測序；
[0042] 2)用引物對1和/或引物對2對植物樣品的基因組DNA進行PCR擴增，若有目的 擴增產(chǎn)物，則所述植物樣品來源于所述轉(zhuǎn)基因棉花ICR24110或其后代；
[0043] 所述引物對1為能夠擴增由所述外源DNA片段5'端和緊鄰其的所述上游側(cè)翼序列 部分或全部片段組成的DNA分子甲的引物對；其對應(yīng)的目的擴增產(chǎn)物為所述DNA分子甲；
[0044] 所述引物對2為能夠擴增含有所述外源DNA片段3'端和緊鄰其的所述下游側(cè)翼序 列的部分或全部組成的DNA分子乙的引物對；其對應(yīng)的目的擴增產(chǎn)物為所述DNA分子乙；
[0045] 3)用能特異結(jié)合所述DNA分子甲或其DNA分子乙的探針對所述待測植物樣品 DNA進行Southern雜交，若能雜交得到雜交片段，則所述植物樣品來源于所述轉(zhuǎn)基因棉花 ICR24110或其后代。
[0046] 上述方法中，
[0047] 2)中，所述引物對1由序列表中序列5所示的單鏈DNA分子和序列表中序列6所 示的單鏈DNA分子組成；
[0048] 所述引物對2由序列表中序列7所示的單鏈DNA分子和序列表中序列8所示的單 鏈DNA分子組成。
[0049] 本發(fā)明的還有一個目的是提供用于檢測樣品是否來源于所述轉(zhuǎn)基因棉花 ICR24110或其后代的試劑盒。
[0050] 本發(fā)明提供的用于檢測樣品是否來源于所述轉(zhuǎn)基因棉花ICR24110或其后代的試 劑盒其包括上述引物對1和/或上述引物對2。
[0051] 上述轉(zhuǎn)基因棉花ICR24110在育種中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0052] 本發(fā)明還有一個目的是提供一種獲得纖維品質(zhì)提高的棉花的方法。
[0053] 本發(fā)明提供的獲得纖維品質(zhì)提高的棉花的方法包括如下步驟：
[0054] (1)按照上述方法獲得轉(zhuǎn)基因棉花；
[0055] (2)將所述轉(zhuǎn)基因棉花自交或雜交，得到繁育后代，按照上述方法鑒定所述繁育后 代，得到目標植株；
[0056] 所述轉(zhuǎn)基因棉花的保藏編號為CCTCC Ν〇·Ρ201518。
[0057] 本發(fā)明的最后一個目的是提供用于轉(zhuǎn)基因棉花的培育的產(chǎn)品。
[0058] 本發(fā)明提供的用于轉(zhuǎn)基因棉花的培育的產(chǎn)品為如下a)_c):
[0059] a)上述上游側(cè)翼片段和上述下游側(cè)翼片段；
[0060] b)上述外源DNA片段；
[0061] c)與上述外源DNA片段相關(guān)的生物材料；
[0062] 所述生物材料為下述A1)至Al 1)中的任一種：
[0063] A1)含有上述外源DNA片段的表達盒；
[0064] A2)含有上述外源DNA片段的重組載體；
[0065] A3)含有A1)所述表達盒的重組載體；
[0066] A4)含有上述外源DNA片段的重組微生物；
[0067] A5)含有A1)所述表達盒的重組微生物