泥螺多肽在抗肺癌中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及泥螺酶解多肽的應(yīng)用，具體涉及泥螺多肽在抗肺癌中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 泥螺（Bullacta exarata)，俗稱"吐鐵"、"黃泥螺"、"梅螺"等，屬軟體動物門、腹足 綱、后鰓亞綱、頭楣目、阿地螺科、泥螺屬，為太平洋西岸海水及咸淡水特產(chǎn)的種類，由貝殼 和軟體兩部分組成，含有豐富的蛋白質(zhì)、鈣、磷、鐵和維生素等成分，多肽物質(zhì)豐富，在我國 廣泛分布于東海和黃海兩側(cè)的長江，是一種常見的水產(chǎn)品。
[0003] 惡性腫瘤是一類嚴(yán)重威脅人類健康和生命的疾病，發(fā)病率越來越高，目前已有的 化療藥物雖對大多數(shù)腫瘤有一定的療效，但選擇性差、毒副反應(yīng)大、耐藥性等問題依然非常 明顯。因此，尋找高效、低毒、特異強的抗腫瘤藥物仍勢在必行。多肽因其分子量小、無免疫 原性、活性高、副作用小，尤其是對多藥抗性的腫瘤細(xì)胞系也有很好的抑制活性。海洋生物 多肽是目前海洋生物活性物質(zhì)研究的一個重要領(lǐng)域，一些生物活性多肽常以非活性狀態(tài)存 在于蛋白質(zhì)中，這些蛋白質(zhì)經(jīng)過蛋白酶的水解作用，使得隱藏于其中的活性肽釋放出來，有 可能發(fā)揮出比蛋白質(zhì)更多的生物活性。例如：如鄧偉等發(fā)現(xiàn)藻藍(lán)蛋白酶解多肽對人宮頸癌 HeLa細(xì)胞株的體外生長有明顯的抑制作用；楊永芳等酶解紫貽貝所得的紫貽貝多肽對前 列腺癌PC-3細(xì)胞和DU-145細(xì)胞有特異性的增殖抑制作用，并且對DU-145細(xì)胞的抑制作用 強于對PC-3細(xì)胞的增殖抑制作用；姚如永等研究泥蚶多肽在0. 25-1. 0g · L 1范圍內(nèi)，多肽 能明顯的抑制肺癌細(xì)胞A549和Ketr-3細(xì)胞的增殖，同時還能抑制細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成，并呈 明顯的劑量依賴性。
[0004] 肺癌是對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一，近年來許多國家都報道肺癌 的發(fā)病率和死亡率均明顯增高，男性肺癌發(fā)病率和死亡率均占所有惡性腫瘤的第一位，女 性發(fā)病率占第二位，死亡率占第二位。因此，研究泥螺酶解多肽在抗肺癌中的作用，做治療 和預(yù)防肺癌具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)而提供一種泥螺酶解多肽在抗肺癌 中的應(yīng)用，尤其是提供對肺癌H1299細(xì)胞增殖抑制的影響。
[0006] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種泥螺多肽在抗肺癌H1299細(xì) 胞藥物中的應(yīng)用，其中藥物的具體實現(xiàn)形態(tài)可為片劑、膠囊劑、顆粒劑或丸劑等。
[0007] 前述泥螺多肽通過以下步驟制得：新鮮泥螺洗凈去殼，取泥螺組織搗碎，加入蒸餾 水勻漿，料液比為1: (3~4)，勻漿后調(diào)節(jié)勻漿液的pH值為8~9,加入0. 4~0. 5%勻漿液 體積的胰蛋白酶，40~50°C保溫水解7~9h，水解完成后于95~100°C、10~15min進(jìn)行 滅酶，4°C下水解液于9500~10000r/min離心15~20min，取上清液濃縮干燥得酶解粗提 物，將酶解粗提物溶于蒸餾水，分離純化得各泥螺多肽組分。
[0008] 所述酶解粗提物的濃度在5~25mg/ml時，對H1299細(xì)胞增殖抑制指數(shù)為35. 3~ 70. 5%，且增殖抑制指數(shù)與酶解粗提物的濃度呈正相關(guān)。
[0009] 作為優(yōu)選，所述分離純化步驟為超濾或依次為超濾和凝膠層析或依次為超濾、凝 膠層析及反相高效液相色譜。
[0010] 進(jìn)一步，所述超濾步驟中分別使用10kd、5kd及3kd超濾膜，對應(yīng)獲得分子量為 10~5kd的組分A1，分子量為5~3kd的組分A2以及分子量小于3kd的組分A3, 20~ 25mg/ml組分A3作用于H1299細(xì)胞36h后的增殖抑制率為70~75 %，且增殖抑制指數(shù)與 組分A3的濃度呈正相關(guān)。
[0011] 進(jìn)一步，所述凝膠層析中選用Sephadex G-25柱對組分A3進(jìn)行洗脫，分別獲得H1 組分、H2組分和H3組分，其中5~20mg/ml組分H2作用于H1299細(xì)胞24h后的增殖抑制指數(shù) 為為44~83%，且增殖抑制指數(shù)與組分H2的濃度呈正相關(guān)；凝膠層析條件：選用S印hadex G-25凝膠層析，裝柱后用去離子水平衡，濃度為50mg/mL、上樣量為4mL、速度為3ml/min，流 動相為超純水，280nm紫外檢測。
[0012] 進(jìn)一步，采用反相高效液相色譜分離所述H2組分，分離獲得組分F1和F2,其 中2. 5~3mg/ml組分F1和組分F2分別作用H1299細(xì)胞24h后，對H1299細(xì)胞的增殖 抑制指數(shù)分別為29~30. 04%和36~37.08% ;反相高效液相色譜條件：選用Zorbax SB-C18 (4. 6 X 250, 5um);柱溫為20°C;流動相為1 % TFA和乙腈；梯度洗脫：從開始到30min 結(jié)束，乙腈濃度從0變化到40%，洗脫速度為1. OmL/min ;進(jìn)樣體積為50ul紫外檢測波長分 別為 214nm、280nm。
[0013] 所述組分F1的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所述，組分F2的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所述。
[0014] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：本發(fā)明選用泥螺為原料，泥螺是一種在我國 海域常見的低值貝類，原材料成本低。利用胰蛋白酶酶解的方法獲取泥螺多肽，反應(yīng)條件溫 和，工藝簡化，時間較短，并且通過超濾法、凝膠柱分離法以及反相高效液相色譜技術(shù)等分 離純化手段獲得各泥螺多肽組分，各組分均能顯著抑制肺癌H1299細(xì)胞增殖，對H1299細(xì)胞 的增殖抑制指數(shù)可達(dá)44. 6%以上，為開發(fā)以泥螺多肽為原料的抗肺癌藥物提供理論依據(jù)。
【附圖說明】
[0015] 圖1為實施例4中泥螺酶解粗提物對肺癌H1299細(xì)胞的抑制率；
[0016] 圖2為實施例4中膜分離組分對H1299細(xì)胞的抑制率；
[0017] 圖3為實施例4中A3組分經(jīng)Sephadex G-25柱層析曲線；
[0018] 圖4為實施例4中凝膠層析組分對H1299細(xì)胞的抑制率的折線圖；
[0019] 圖5為實施例4中凝膠層析組分對H1299細(xì)胞的抑制率的柱狀圖；
[0020] 圖6為實施例4中H2組分的反相高效液相圖譜；
[0021] 圖7反相高效液相色譜純化的組分對H1299細(xì)胞的抑制率。
【具體實施方式】
[0022] 以下結(jié)合附圖實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0023] 實施例1 :泥螺多肽的制備
[0024] (1. 1)原料處理
[0025] 取新鮮泥螺，將泥螺去殼、浙干后備用。
[0026] (1. 2)泥螺酶解工藝
[0027] 用高速組織搗碎機(jī)將泥螺組織搗碎，加入蒸餾水勻漿，料液比1:4,精密稱取勻漿 液，用0· lmol/L的鹽酸溶液和0· lmol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)勻漿液pH值，加入胰蛋白酶酶解 數(shù)小時，酶解條件為：酶解溫度45°C，pH為8. 7,酶解時間8h，加酶量0. 48%。100°C下滅酶 15min，4°C下離心15min (10000r/min)，取上清液濃縮備用。
[0028] 實施例2 :H1299細(xì)胞的培養(yǎng)和傳代
[0029] (2. 1)細(xì)胞復(fù)蘇
[0030] 從液氮罐中取出存放的H1299細(xì)胞株，快速的放入37°C恒溫水浴鍋中進(jìn)行融化， 待融化后進(jìn)入無菌工作室進(jìn)行操作，用滅菌好的吸管將細(xì)胞株吸入離心管，加入2mL的F12 營養(yǎng)液或RPMI1640營養(yǎng)液，lOOOrpm離心10min，去上清液，加入4ml的營養(yǎng)液，反復(fù)吹打使 細(xì)胞成為單個細(xì)胞。然后用吸管將細(xì)胞均勻的吸入到2個25mL的培養(yǎng)瓶中，放入5% C02、 37°C的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，次日換液倒掉未貼壁的死亡細(xì)胞。
[0031] (2. 2)細(xì)胞培養(yǎng)
[0032] 將人肺癌細(xì)胞H1299接種到分別含有10 %胎牛血清（體積分?jǐn)?shù)）FBS和雙抗（青 霉素 G100IU/mL、鏈霉素100IU/mL)的F12和1640營養(yǎng)液中，放置于37°C、5% C02的恒溫培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長，每1天換液一次，待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶的80 %左右時進(jìn)行傳代。 按照1 : 2的比例進(jìn)行傳代，收集對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。
[0033] (2. 3)細(xì)胞傳代
[0034] 先將長滿細(xì)胞的培養(yǎng)瓶從恒溫培養(yǎng)箱中取出放到無菌操作臺上。傳代時，先倒掉 瓶中的營養(yǎng)液，去除不貼壁生長的死細(xì)胞，用〇. 25%胰蛋白酶/0. 02% EDTA消化液混合消 化，不同細(xì)胞消化的時間不同，一般消化時間為3-5min ;顯微鏡下觀察細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞間隙明 顯變大且細(xì)胞變圓變亮?xí)r，說明細(xì)胞已經(jīng)消化完畢，去掉消化酶液。在培養(yǎng)瓶中加入2. 5mL 左右的營養(yǎng)液，反復(fù)吹打消化好的貼壁細(xì)胞使之成為單個細(xì)胞，一般情況下一瓶細(xì)胞傳2 瓶，將傳代好的細(xì)胞置于37°C、5% C02的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0035] (2. 4)細(xì)胞凍存
[0036] 顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞長到培養(yǎng)瓶的80%左右，選細(xì)胞形態(tài)好的進(jìn)行凍存，倒去培 養(yǎng)液，加入消化液對細(xì)胞進(jìn)行消化，鏡下觀察細(xì)胞間隙明顯時倒掉消化酶，再向培養(yǎng)瓶中加 入3mL左右的營養(yǎng)液，反復(fù)吹打使之成為單個細(xì)胞，吸入離心管內(nèi)，lOOOrpm，離心10min，小 心的吸棄培養(yǎng)液，加入含有10% DMS0胎牛血清lmL，用吸管反復(fù)吹打細(xì)胞均勻后，吸入到無 菌凍存管中。先放入4°C冰箱中30min后，再放入液氮瓶口位置2h，最后放入液氮瓶中進(jìn)行 凍存。
[0037] :實施例3 :酶解粗提物的分離純化
[0038] 首先選用超濾法對泥螺多肽酶解粗提液進(jìn)行分離，超濾膜分別選用10kd，5kd， 3kd，分別截留到分子量10-5kd、5-3kd和小于3kd三個組分，冷凍干燥后分別配成20mg/mL 的濃度，用MTT法測定各個組分對肺癌H1299的抑制率。選出活性最高的一個組分，選用 S印hadex G-25凝膠層析，裝柱后用去離子水平衡，濃度為50mg/mL、上樣量為4mL、速度為 3ml/min，流動相為超純水，280nm紫外檢測。收集洗脫峰冷凍干燥成粉末，檢測對H1299細(xì) 胞的增殖抑制率，并繪制曲線得出IC5。（半數(shù)抑制濃度），將活性最高的大量收集冷凍干燥 進(jìn)行高效液相色譜分析。
[0039] 將冷凍干燥好的泥螺樣品用0. 06 % TFA的水溶解到0. 6ml的離心管中，在 12000rpm，離心10min取上清液。高效液相條件：選用Zorbax SB_C18(4.6X250,5um);柱 溫為20°C ;流動相為1% TFA和乙腈；梯度洗脫：從開始到30min結(jié)束，乙腈濃度從0變化 到40%，洗脫速度為1. OmL/min ;進(jìn)樣體積為50ul紫外檢測波長分別為214nm、280nm。
[0040] 實施例4 :MTT法探索泥螺多肽抗腫瘤活性
[0041] 取對數(shù)生長期的細(xì)胞制成懸液，接種至96孔板，每孔200 μ L，設(shè)5個平行孔，于 5% C02,37°C貼壁16-48h，倒置顯微鏡下觀察，棄去培養(yǎng)液，同時將待測樣品以不同濃度分 別溶于培養(yǎng)液中。然后分別加入每個孔，同時設(shè)不加樣品的對照組，置5% C02,37°C培養(yǎng)箱 中孵育36h，