系統(tǒng)性紅斑狼瘡生物標(biāo)志物及其診斷試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種系統(tǒng)性紅斑狼瘡?fù)庵苎狣NA甲基化標(biāo)志物以及一種用于系統(tǒng)性 紅斑狼瘡的診斷試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE)是一種多器官、多系統(tǒng)受 累的自身免疫性疾病。臨床表現(xiàn)為腎臟、神經(jīng)精神系統(tǒng)、血液系統(tǒng)等多器官受損。如果能夠 在SLE患者出現(xiàn)重要器官受累前進(jìn)行早期診斷對(duì)于SLE的防治、改善患者的生活質(zhì)量、提高 患者生存率具有重大意義。然而，目前的生物學(xué)診斷標(biāo)志物大多是在器官受損后出現(xiàn)的生 化和免疫學(xué)改變，無法對(duì)SLE患者器官受累進(jìn)行早期診斷。
[0003] 近年來，表觀遺傳學(xué)標(biāo)記物研究發(fā)展迅速，許多表觀遺傳標(biāo)志物如DNA甲基化標(biāo) 記物、血清microRNA標(biāo)記物被篩選和鑒定，這些標(biāo)記物對(duì)于疾病的早期診斷和預(yù)后判斷具 有重要價(jià)值。已有大量文獻(xiàn)證實(shí)DNA低甲基化在SLE患者⑶4+T細(xì)胞異?；罨癝LE發(fā)生 發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。目前，已經(jīng)鑒定的在SLE患者⑶4+Τ細(xì)胞中發(fā)生低甲基化的基因 包括⑶11a、⑶70、⑶40L和Perforin等。這些基因的低甲基化導(dǎo)致其過度表達(dá)，從而誘導(dǎo) T細(xì)胞自身反應(yīng)性活化，導(dǎo)致SLE發(fā)生。其中⑶11a和⑶70基因啟動(dòng)子調(diào)控序列的甲基化 已經(jīng)被證明可以用于SLE的輔助診斷。然而，這種方法限制在檢測(cè)外周血⑶4+T細(xì)胞基因組 中的CDlla和CD70基因甲基化水平。這就要求我們首先要收集較多的患者外周血樣本(約 20ml左右)，然后利用密度梯度離心法和免疫磁珠分選法分離外周血中的⑶4+T細(xì)胞。由于 抽取患者血液樣本較多，患者的醫(yī)從性較低；而且CD4+T細(xì)胞分選的實(shí)驗(yàn)成本較高、實(shí)驗(yàn)耗 時(shí)較長(zhǎng)，增加了患者的負(fù)擔(dān)。另外，檢測(cè)CDlla和CD70基因甲基化以往采用克隆測(cè)序法、自 制芯片法，耗時(shí)較長(zhǎng)，且無法給出一個(gè)精確的甲基化定量水平，給臨床上推廣應(yīng)用帶來了困 難。
[0004] 目如臨床上尚無一種尚敏感性尚特異性的SLE診斷指標(biāo)，即使是自身抗體如抗 ANA抗體，其對(duì)SLE的診斷敏感性為95%，但診斷特異性相對(duì)較低65%。為此，患者必須檢查 許多實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)聯(lián)合輔助診斷SLE，導(dǎo)致疾病的診療成本大大增加，加重了患者的負(fù)擔(dān)。因 此，開發(fā)新的SLE診斷標(biāo)志物十分必要，對(duì)提高SLE的診療水平具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于針對(duì)傳統(tǒng)的系統(tǒng)性紅斑狼瘡實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)靈敏度或特異性 不高的問題，克服現(xiàn)有技術(shù)方法的不足，提供一種新的高靈敏高特異性的SLE患者外周血 DNA甲基化標(biāo)志物，并相應(yīng)提供一種用于診斷SLE的靈敏度和特異性均較高的檢測(cè)試劑盒。
[0006] 發(fā)明人經(jīng)過長(zhǎng)期研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生于基因組上的表觀遺傳學(xué)修飾在SLE的發(fā)生、發(fā) 展中發(fā)揮重要作用，一些異常的DNA甲基化修飾可能作為SLE早期診斷的標(biāo)志物。通過對(duì) 大樣本SLE患者、健康人、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血細(xì)胞中IFI44L基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上 游1500bp內(nèi)的序列進(jìn)行DNA甲基化檢測(cè)，證實(shí)其包含的兩個(gè)CG位點(diǎn)的甲基化水平分別在 SLE患者中較健康對(duì)照、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者顯著降低，這兩個(gè)CG位點(diǎn)低甲基化用于診斷 SLE的靈敏度和特異性均很高。
[0007] 本發(fā)明所述一種高靈敏、高特異性的SLE患者外周血DNA甲基化標(biāo)志物是人 IFI44L基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1500bp內(nèi)的一段DNA序列，即位于人類基因組1號(hào)染色體 79,085, 190-79, 085, 311段(人類基因組數(shù)據(jù)hgl9版本)，其DNA序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 上述DNA序列包含兩個(gè)CG位點(diǎn)，其甲基化水平在SLE患者外周血細(xì)胞中較健康對(duì) 照顯著降低，與疾病對(duì)照類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相比亦明顯降低。
[0009] 本發(fā)明還提出SEQ ID NO. 1所定義DNA序列的生物標(biāo)記物在制備SLE診斷試劑中 的應(yīng)用，該應(yīng)用包括測(cè)定受試者外周血細(xì)胞中SEQ ID NO. 1所定義DNA序列包含的兩個(gè)CG 位點(diǎn)的甲基化水平。
[0010] 具體來說，可以通過PCR擴(kuò)增目的DNA片段并測(cè)序后通過軟件分析測(cè)序結(jié)果來判 斷受試者外周血中的IFI44L基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1500bp內(nèi)DNA序列的甲基化水平，包 括下述步驟：（1)抽提受試者外周血全基因組DNA ; (2)測(cè)定抽提的基因組DNA濃度；（3) 亞硫酸鹽處理基因組DNA ; (4)特異性PCR引物擴(kuò)增待測(cè)DNA片段；（5)電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物； (6)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序；（7)分析測(cè)序結(jié)果，獲得待測(cè)序列中包含的兩個(gè)CG位點(diǎn)的甲基化 水平。
[0011] 本發(fā)明的另一目的還在于提供一種用于SLE診斷的試劑盒，該試劑盒包含SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示的一組PCR引物以及如SEQ ID NO. 4所示的測(cè)序探針，以及任 意需要的試劑或介質(zhì)，如外周血細(xì)胞基因組DNA抽提、DNA濃度測(cè)定、亞硫酸氫鹽處理、PCR 分析、電泳、焦磷酸測(cè)序分析。具體來說，所述試劑盒可以進(jìn)一步包括一種或多種選自由以 下所組成的組中的成分：脫氧核糖核苷三磷酸、緩沖劑、穩(wěn)定劑、熱穩(wěn)定DNA聚合酶和標(biāo)記 物，包括熒光標(biāo)記物、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物和放射性標(biāo)記物。
[0012] 本發(fā)明檢測(cè)SEQ ID NO. 1序列兩個(gè)CG位點(diǎn)的甲基化水平需要設(shè)計(jì)特異性PCR引 物擴(kuò)增SEQ ID NO. 1所述DNA片段，引物設(shè)計(jì)是根據(jù)包含SEQ ID NO. 1所述目的DNA序 列及該段序列上下游200bp核苷酸的DNA序列設(shè)計(jì)，引物序列為：上游引物5' -TGTGGAT AGTGATAATTTGTTATAAAGTAA-3'（如 SEQ ID N0. 2 所示）；下游引物 5' -AACCTCATCCAATCTT AAAACACTTATA-3'（如SEQ ID N0. 3所示)，下游引物的5'端用生物素 biotin標(biāo)記。本 發(fā)明用于焦磷酸測(cè)序檢測(cè)目的DNA片段中的CG位點(diǎn)甲基化水平需要特殊的探針，根據(jù) IFI44L基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1500bp內(nèi)的SEQ ID NO. 1所述序列設(shè)計(jì)測(cè)序探針，序列為： 5'-AATGTTGTTATTTTATTTTAGATAG-3'（如 SEQ ID 勵(lì).4所示）。
[0013] 本發(fā)明利用Illumina公司的DNA甲基化芯片（Illumina 450K)在國(guó)際上首次篩 選SLE患者外周全血細(xì)胞中差異DNA甲基化修飾基因。通過大規(guī)模臨床樣本篩查、利用最 新的遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)檢測(cè)技術(shù)，尋找到SLE患者的早期診斷標(biāo)記物，建立相應(yīng)的檢測(cè) 方法，從而開發(fā)出SLE早期診斷試劑盒。通過與正常人外周血樣本相比，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)IFI44L 是SLE患者外周血中DNA甲基化改變最顯著的基因之一。發(fā)明人通過擴(kuò)大樣本也進(jìn)一步證 實(shí)SLE患者外周血細(xì)胞中IFI44L基因起始位點(diǎn)上游1500bp內(nèi)的一段序列DNA甲基化水平 較正常人和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA)患者顯著降低。IFI44L屬于I型干擾素通路，是一種干擾 素誘導(dǎo)基因。I型干擾素通路在SLE發(fā)病過程中起十分重要的作用。因此，IFI44L可以作 為SLE診斷的標(biāo)志。
[0014] 本發(fā)明所提供的SLE診斷試劑盒克服了現(xiàn)有SLE檢測(cè)技術(shù)方法的不足，僅需要抽 取不超過lml的患者外周血，從SLE患者外周血中找到DNA甲基化標(biāo)志物，因此顯著提高患 者的醫(yī)從性。本發(fā)明的試劑盒特異性和靈敏度高，檢查耗時(shí)短，操作簡(jiǎn)單，需要的標(biāo)本量少， 易于臨床上廣泛推廣，應(yīng)用前景廣闊。利用焦磷酸測(cè)序儀配合特異性引物和探針可以大大 縮短DNA甲基化的檢查時(shí)間，大大了提高實(shí)驗(yàn)室檢查的效率和檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性和特異性 (均可達(dá)到90%以上)。該項(xiàng)新技術(shù)和產(chǎn)品開發(fā)與應(yīng)用將對(duì)于提高SLE的診治水平，提高SLE 患者的生存質(zhì)量和生存率具有十分重要的意義。
【附圖說明】
[0015] 圖1為特異性引物PCR擴(kuò)增目的DNA片段（SEQ ID NO. 1)的電泳圖。
[0016] 圖2為CG位點(diǎn)1的甲基化在SLE患者、健康對(duì)照和RA患者中的差異。
[0017] 圖3為CG位點(diǎn)2的甲基化在SLE患者、健康對(duì)照和RA患者中的差異。
[0018] 圖4為CG位點(diǎn)1的甲基化水平用于SLE診斷的R0C曲線圖（與健康對(duì)照相比)。
[0019] 圖5為CG位點(diǎn)2的甲基化水平用于SLE診斷的R0C曲線圖（與健康對(duì)照相比)。
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