朱鹮抗病毒潛力檢測(cè)的i類mhc基因的特異性引物及分型方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明提供了用于擴(kuò)增朱鹮I類MHC各位點(diǎn)基因序列的引物及在此基礎(chǔ)上的利 用單鏈構(gòu)象多態(tài)性（Single-Strand Conformation Polymor_phism，SSCP)技術(shù)進(jìn)行基因分 型的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 朱鹮，世界瀕危物種及國(guó)家以及重點(diǎn)保護(hù)動(dòng)物，隸屬鳥綱鵜形目鹮科朱鹮屬，是一 種中等體型的涉禽，曾經(jīng)廣泛分布于東亞的中國(guó)、俄羅斯、日本和朝鮮半島等地區(qū)。19世紀(jì) 末20世紀(jì)初，由于人類活動(dòng)等原因朱鹮種群數(shù)量大幅減少，俄羅斯、朝鮮半島和日本的野 生個(gè)體相繼絕跡，直到1981年科研人員在我國(guó)陜西省洋縣秦嶺山中重新發(fā)現(xiàn)了 7只野生朱 鹮，這7只個(gè)體也成為了當(dāng)前全球范圍內(nèi)所有已知個(gè)體的奠基者。
[0003] 為了保護(hù)這一物種，中國(guó)政府及研究機(jī)構(gòu)商討制定了以就地保護(hù)為主，異地保護(hù) 兼并的朱鹮拯救計(jì)劃。1986年中國(guó)建立了陜西省朱鹮保護(hù)觀察站進(jìn)行就地保護(hù)，北京、河 南、浙江等地也相繼展開了異地保護(hù)。經(jīng)過幾十年的保護(hù)工作，雖然朱鹮種群數(shù)量在逐步回 升，但仍未走出瀕危的現(xiàn)狀，由于目前全球范圍的已知個(gè)體均為1981年重新發(fā)現(xiàn)的兩對(duì)朱 鹮親本的后代，近親交配嚴(yán)重，存在繁殖能力低下、幼鳥死亡殘疾率較高等問題。
[0004] 主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex, MHC)，作為脊椎動(dòng) 物免疫系統(tǒng)中的關(guān)鍵角色，包含一系列多基因家族成員，其中I類MHC基因能夠識(shí)別細(xì)胞 質(zhì)中的內(nèi)源性抗原（如病毒）的多肽，并將其呈遞給CD8+T細(xì)胞或自然殺傷性細(xì)胞，從而引 發(fā)后續(xù)的免疫反應(yīng)。I類MHC分為經(jīng)典基因和非經(jīng)典基因，經(jīng)典I類基因負(fù)責(zé)呈遞抗原，而 非經(jīng)典基因的呈遞抗原能力退化或功能轉(zhuǎn)變成輔助經(jīng)典I類基因的抗原肽呈遞。經(jīng)典I類 MHC基因的抗原結(jié)合區(qū)由外顯子2與外顯子3共同編碼組成，由于其負(fù)責(zé)識(shí)別抗原肽，因此 通常在抗原結(jié)合區(qū)上具有顯著的多態(tài)性，其抗原結(jié)合區(qū)多態(tài)性高的個(gè)體能夠更好的抵抗病 毒的入侵。通過評(píng)估人工種群中I類經(jīng)典MHC基因的多態(tài)性，保護(hù)工作者在進(jìn)行新建種群 選擇奠基者與野外放歸選擇適應(yīng)性能力強(qiáng)的個(gè)體等工作時(shí)，可以根據(jù)多態(tài)性高低進(jìn)行科學(xué) 地選擇，在圈養(yǎng)種群進(jìn)行人工配對(duì)時(shí)，可以選擇具有不同等位基因的個(gè)體配對(duì)從而提高子 代的多態(tài)性，增強(qiáng)子代對(duì)病毒性疾病的抵抗力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了擴(kuò)增朱鹮I類MHC基因各經(jīng)典座位的特異性引物及在此基礎(chǔ)上的 SSCP基因分型方法，使用本發(fā)明提供的引物能夠有效擴(kuò)增各位點(diǎn)核苷酸序列，并以此PCR 產(chǎn)物為基礎(chǔ)運(yùn)用SSCP-HD技術(shù)進(jìn)行基因型分型。
[0006] 用于朱鹮I類MHC基因序列擴(kuò)增的引物組包含5對(duì)引物，引物對(duì)的引物序列如 下：
[0007] 引物對(duì)一：上游引物如SEQ ID NO. 1所示；
[0008] 下游引物如SEQ ID NO. 2所示；
[0009] 引物對(duì)二：上游引物如SEQ ID NO. 3所示；
[0010] 下游引物如SEQ ID Ν(λ 4所示；
[0011] 引物對(duì)三：上游引物如SEQ ID NO. 5所示；
[0012] 下游引物如SEQ ID NO. 6所示；
[0013] 引物對(duì)四：上游引物如SEQ ID NO. 7所示；
[0014] 下游引物如SEQ ID Ν0· 8所示；
[0015] 引物對(duì)五：上游引物如SEQ ID NO. 9所示；
[0016] 下游引物如SEQ ID Ν0· 10所示。
[0017] -種朱鹮I類MHC基因分型方法采用所述的五對(duì)引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每對(duì)引 物均在10uL PCR體系中，并在特定的PCR擴(kuò)增條件下進(jìn)行目標(biāo)片段擴(kuò)增，然后運(yùn)用SSCP分 型方法進(jìn)行基因分型。
[0018] 所述的10uL PCR體系是：
[0019] 2XGC Buffer I SuL 濃度為 2, 5mM 的 dNTP 0. SuL 濃度為10uM的上游引物 0. 3uL 濃度為10uM的下游引物 0, :3uL gDNA luL 濃度為 5U/uL 的 Ex-Taq Θ. luL 雙蒸水 ：L5:uL·。
[0020] 所述的特定的PCR擴(kuò)增條件是：1) 95°C預(yù)變性5分鐘；2) 95°C變性30秒；3)在退 火溫度下下退火；4)72°C復(fù)性30秒；5)重復(fù)步驟2)至步驟4)32次；6)72°C延伸5分鐘； 其中不同引物對(duì)使用的退火溫度和退火時(shí)間不同，第一對(duì)引物的退火溫度為61°C，退火時(shí) 間為30秒；第二對(duì)引物的退火溫度為67°C，退火時(shí)間為30秒；第三對(duì)引物的退火溫度為 60°C，退火時(shí)間為25秒；第四對(duì)引物的退火溫度為61°C，退火時(shí)間為20秒；第五對(duì)引物的 退火溫度為60 °C，退火時(shí)間為25秒。
[0021] 所述的SSCP分型方法中，固定后、銀染后以及顯色后應(yīng)分別使用雙蒸水洗膠4次， 以獲得清晰的SSCP條帶。
[0022] 所述的SSCP分型方法是：
[0023] 1)用玻璃洗滌劑清洗大小玻璃板，瀝水后用酒精棉擦拭3次，并待酒精揮發(fā)后裝 板，將間隔條置于大小玻璃板間，并用專用架將兩邊夾緊，固定于模具上；
[0024] 2)制備12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠膠液，將膠液混勻后慢慢注入大小玻璃板 間，確認(rèn)無氣泡存在后插入梳子，常溫平置；
[0025] 3)待膠凝固后，從模具上卸下并架于電泳裝置上，用瓊脂糖封膠；取下梳子，并用 裝滿0. 5XTBE的注射器沖洗點(diǎn)樣孔；放入電泳槽中，倒入0. 5XTBE，預(yù)電泳20min ;
[0026] 4)樣品電泳，吸取8uL PCR產(chǎn)物，加入4uL 2 X loading buffer，快速離心混合， 95°C變性7min后迅速置于冰上，并用槍及時(shí)加入點(diǎn)樣孔內(nèi)，4°C，30W，電泳8-llh ;
[0027] 5)將膠從玻璃板間卸下，加入500mL固定液，于搖床上固定30min，倒掉固定液，倒 入500mL雙蒸水洗膠4次；
[0028] 6)加入500mL銀染液，于搖床上銀染30min，倒掉銀染液，使用500mL雙蒸水迅速 洗膠4次；
[0029] 7)加入500mL預(yù)冷的顯影液，于搖床顯影，等待條帶清晰后倒去顯影液，加入 500mL固定液終止顯影，倒掉固定液，倒入500mL雙蒸水洗膠4次；
[0030] 8)讀取條帶，確定基因型。
[0031] 本發(fā)明提供的引物SEQ ID NO. 1~SEQ ID N0. 10可以有效擴(kuò)增朱鹮MHC I類經(jīng)典 基因的UAA、UBA、UCA1和UCA2四個(gè)位點(diǎn)的抗原肽結(jié)合區(qū)（peptide-binding region，PBR) 序列，本研究初期嘗試采用巢式特異性PCR，但未得到清晰單一并可用于SSCP分型的PCR 結(jié)果，主要問題在于位點(diǎn)間的交叉擴(kuò)增。因此，考慮到PBR外顯子的旁側(cè)內(nèi)含子序列相似度 高，且之前對(duì)朱鹮種群的各項(xiàng)遺傳結(jié)構(gòu)研究均顯示低水平的遺傳多樣性，遂最終主要采用 一輪位點(diǎn)通用引物結(jié)合SSCP-HD技術(shù)對(duì)I類位點(diǎn)進(jìn)行多位點(diǎn)同步分型。
[0032] I類MHC基因的分型除采用上述的同部分性方法外，由于某些位點(diǎn)等位基因僅具 有單間及差異，以及不同位點(diǎn)間等位基因序列相同的情況，又進(jìn)一步結(jié)合位點(diǎn)特異性引物 擴(kuò)增、SSCP分型以及測(cè)序技術(shù)對(duì)這些特殊位點(diǎn)進(jìn)行了基因型確認(rèn)，即精密分型。
[0033] 擴(kuò)增各位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的引物如下表所示：
[0035] 同步分型引物為SEQ ID NO. 1與SEQ ID N0. 2引物對(duì)，以及SEQ ID N0. 3與SEQ ID NO. 4引物對(duì)，前者同步擴(kuò)增各位點(diǎn)的外顯子2,后者同步擴(kuò)增外顯子3。外顯子2的分型 結(jié)果顯示，SSCP帶型雙鏈區(qū)包含了各位點(diǎn)等位基因兩兩結(jié)合形成的多條異源雙鏈條帶，每 種條帶組合即為一種帶型，共3種帶型，兩種純合帶型，一種雜合帶型，分別對(duì)應(yīng)了二態(tài)位 點(diǎn)UAA在外顯子2上的三種基因型，可以發(fā)現(xiàn)兩種純合子帶型互補(bǔ)，雜合子為它們的疊加。 通過測(cè)序發(fā)現(xiàn)，UCA1與UCA2的外顯子2序列一致。外顯子3的分型結(jié)果顯示，二態(tài)位點(diǎn) UAA造成了三種最主要的帶型，兩種純合子帶型和一種雜合子帶型，雜合子帶型為純合子帶 型的疊加。二態(tài)位點(diǎn)UBA造成了三種差異較小的帶型，為減少分型誤差，在后續(xù)對(duì)這一位點(diǎn) 進(jìn)行精密分型。由于二態(tài)位點(diǎn)UDA的一個(gè)等位基因 UCA2*01與單態(tài)位點(diǎn)UCA1具有一致的 外顯子3序列，因此UDA位點(diǎn)只有兩種SSCP帶型，也需要后續(xù)進(jìn)一步精密分型。
[0036] 對(duì)于上述需要進(jìn)行精密分型的UBA(SEQ ID N0. 7和SEQ ID N0. 8)態(tài)位點(diǎn)，通過單 鏈構(gòu)象比較進(jìn)行了精密分型。分型結(jié)果與隨機(jī)抽樣調(diào)查的測(cè)序結(jié)果一致，證明其可靠性。 UBA的分型結(jié)果顯示了三種帶型，兩種純合子和一種雜合子，雜合子為純合子帶型的疊加。 UCA2的分型分為外顯子3(SEQ ID N0. 5和SEQ ID N0. 6)和內(nèi)含子1 (SEQ ID N0. 9和SEQ ID NO. 10)兩個(gè)部分，均為單個(gè)堿基差異，由于UCA1的干擾，只能通過外顯子3的SSCP帶型 辨別出UCA2位點(diǎn)是否含有與UCA1位點(diǎn)等位基因不一致的等位基因 UCA2*02,需要再通過內(nèi) 含子1上的差異堿基測(cè)序進(jìn)一步辨別UCA2*01/*02和UCA2*02/*02兩種基因型。
【附圖說明】
[0037] 圖1顯示的是第一對(duì)引物擴(kuò)增的目的片段大小為310bp的I -E2位點(diǎn)基因序列。
[0038] 圖2顯示的是第四對(duì)引物擴(kuò)增的目的片段大小為150bp的I -UBA-E3位點(diǎn)基因序 列。
[0039] 圖3顯示的是第一對(duì)引物所擴(kuò)增的位點(diǎn)I -E2的SSCP分型條帶圖，一共有三種帶 型。
[0040] 圖4顯示的是第四對(duì)引物所擴(kuò)增的位點(diǎn)I -UBA-E3的SSCP分型條帶圖，一共有三 種帶型。
【具體實(shí)施方式】
[0041] 本發(fā)明提供的朱鹮MHC I類PBR外顯子引物篩選及基因分型分為以下步驟：1、根 據(jù)已得的朱鹮MHC基因序列設(shè)計(jì)特異性引物；2、通過PCR擴(kuò)增檢測(cè)各位點(diǎn)引物的有效性； 3、運(yùn)用