Znrd1基因及其表達(dá)產(chǎn)物作為顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的診治靶標(biāo)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及人ZNRD1基因在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的診斷、治療 中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 盧頁(yè)內(nèi)動(dòng)脈瘤（Intracranial Aneurysm)是指多種因素造成的顏內(nèi)動(dòng)脈壁結(jié)構(gòu)破 壞，進(jìn)而導(dǎo)致的動(dòng)脈壁異常膨出。顱內(nèi)動(dòng)脈瘤發(fā)病率較高，尸體解剖檢出率約為1-5%。顱 內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂出血后30天的死亡率達(dá)45%，存活者中30%存在不同程度的殘疾，嚴(yán)重威脅 人類的生命健康。然而，關(guān)于顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的發(fā)病機(jī)制并不明確，其可能與遺傳、高血壓、血流 動(dòng)力學(xué)、獲得性血管壁損傷有關(guān)。
[0003] 如果在IA破裂之前進(jìn)行有效的預(yù)防和處理，患者的總體預(yù)后將大大改善。當(dāng)前， 對(duì)顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的診斷和篩選主要依賴腦血管造影（DSA)和磁共振血管造影（MRA)及CT血 管造影（CTA)。三種方法均存在費(fèi)用昂貴、假陰性率高的缺點(diǎn)，同時(shí)作為金標(biāo)準(zhǔn)的DSA還是 一種有創(chuàng)性檢查，難以被普通人群所接受，因此臨床上迫切需要改變當(dāng)前的診治格局，以便 對(duì)IA患者作出早期診斷和篩選，并進(jìn)行相應(yīng)的有效處理，最終改善患者的總體預(yù)后。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種可用于顱內(nèi)動(dòng)脈瘤早期診 斷的分子標(biāo)志物。相比傳統(tǒng)的顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的診斷方法，使用基因標(biāo)志物來(lái)診斷顱內(nèi)動(dòng)脈瘤 的具有及時(shí)性、特異性和靈敏性，從而使患者在疾病早期就能知曉疾病風(fēng)險(xiǎn)，針對(duì)風(fēng)險(xiǎn)高 低，采取相應(yīng)的預(yù)防和治療措施。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0006] 本發(fā)明提供了檢測(cè)ZNRD1基因表達(dá)的產(chǎn)品在制備診斷顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的工具中的應(yīng) 用。
[0007] 進(jìn)一步，所述檢測(cè)ZNRD1基因表達(dá)的產(chǎn)品包括檢測(cè)ZNRD1基因 mRNA水平的產(chǎn)品、 和/或檢測(cè)ZNRD1蛋白水平的產(chǎn)品。
[0008] 進(jìn)一步，所述檢測(cè)ZNRD1基因表達(dá)的產(chǎn)品包括：通過RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、免疫檢 測(cè)、原位雜交或芯片檢測(cè)ZNRD1基因及其表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平以診斷顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的產(chǎn)品。
[0009] 進(jìn)一步，所述用RT-PCR診斷顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增ZNRD1基因 的引物；所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增ZNRD1基因的 引物；所述用免疫檢測(cè)診斷顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的產(chǎn)品包括：與ZNRD1蛋白特異性結(jié)合的抗體；所述 用原位雜交診斷顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的產(chǎn)品包括：與ZNRD1基因的核酸序列雜交的探針；所述用芯 片診斷顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的產(chǎn)品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括與ZNRD1蛋白特 異性結(jié)合的抗體，基因芯片包括與ZNRD1基因的核酸序列雜交的探針。
[0010] 所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的產(chǎn)品至少包括的一對(duì)特異擴(kuò)增ZNRD1基因 的引物如SEQ ID N0. 11和SEQ ID N0. 12所示。
[0011] 所述檢測(cè)ZNRD1基因表達(dá)的產(chǎn)品可以是檢測(cè)ZNRD1基因表達(dá)的試劑、也可以是包 含所述試劑的試劑盒、芯片、試紙等，也可以是使用所述試劑的高通量測(cè)序平臺(tái)。
[0012] 所述診斷顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量測(cè)序平 臺(tái)；高通量測(cè)序平臺(tái)是一種特殊的診斷顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的工具，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，對(duì) 一個(gè)人的基因表達(dá)譜的構(gòu)建將成為十分便捷的工作。通過對(duì)比疾病患者和正常人群的基因 表達(dá)譜，容易分析出哪個(gè)基因的異常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測(cè)序中獲知ZNRD1基因的 異常與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤相關(guān)也屬于ZNRD1基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種診斷顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的工具，所述工具包括檢測(cè)ZNRD1基因表達(dá) 的試劑；所述試劑包括檢測(cè)ZNRD1基因 mRNA的引物和/或探針、和/或檢測(cè)ZNRD1蛋白的 抗體。
[0014] 所述工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量測(cè)序平臺(tái)。
[0015] 其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片；所述基因芯片包括固相載體以及固 定在固相載體的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括用于檢測(cè)ZNRD1基因轉(zhuǎn)錄水平的 針對(duì)ZNRD1基因的寡核苷酸探針；所述蛋白質(zhì)芯片包括固相載體以及固定在固相載體的 ZNRD1蛋白的特異性抗體；所述基因芯片可用于檢測(cè)包括ZNRD1基因在內(nèi)的多個(gè)基因（例 如，與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤相關(guān)的多個(gè)基因）的表達(dá)水平。所述蛋白質(zhì)芯片可用于檢測(cè)包括ZNRD1 蛋白在內(nèi)的多個(gè)蛋白質(zhì)（例如與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤相關(guān)的多個(gè)蛋白質(zhì)）的表達(dá)水平。通過將多個(gè) 與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的標(biāo)志物同時(shí)檢測(cè)，可大大提高顱內(nèi)動(dòng)脈瘤診斷的準(zhǔn)確率。
[0016] 其中，所述試劑盒包括基因檢測(cè)試劑盒和蛋白免疫檢測(cè)試劑盒；所述基因檢測(cè)試 劑盒包括用于檢測(cè)ZNRD1基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑；所述蛋白免疫檢測(cè)試劑盒包括ZNRD1蛋白 的特異性抗體。進(jìn)一步，所述試劑包括使用RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、免疫檢測(cè)、原位雜交或芯 片方法檢測(cè)ZNRD1基因表達(dá)水平過程中所需的試劑。優(yōu)選度，所述試劑包括針對(duì)ZNRD1基 因的引物和/或探針。根據(jù)ZNRD1基因的核苷酸序列信息容易設(shè)計(jì)出可以用于檢測(cè)ZNRD1 基因表達(dá)水平的引物和探針。
[0017] 所述試紙包括檢測(cè)ZNRD1基因表達(dá)的試劑。
[0018] 所述高通量測(cè)序平臺(tái)包括檢測(cè)ZNRD1基因表達(dá)的試劑。
[0019] 與ZNRD1基因的核酸序列雜交的探針可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其 它衍生物。所述探針的長(zhǎng)度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結(jié) 合，任何長(zhǎng)度都可以。所述探針的長(zhǎng)度可短至25、20、15、13或10個(gè)堿基長(zhǎng)度。同樣，所述 探針的長(zhǎng)度可長(zhǎng)至60、80、100、150、300個(gè)堿基對(duì)或更長(zhǎng)，甚至整個(gè)基因。由于不同的探針 長(zhǎng)度對(duì)雜交效率、信號(hào)特異性有不同的影響，所述探針的長(zhǎng)度通常至少是14個(gè)堿基對(duì)，最 長(zhǎng)一般不超過30個(gè)堿基對(duì)，與目的核苷酸序列互補(bǔ)的長(zhǎng)度以15-25個(gè)堿基對(duì)最佳。所述探 針自身互補(bǔ)序列最好少于4個(gè)堿基對(duì)，以免影響雜交效率。
[0020] 進(jìn)一步，所述ZNRD1蛋白的特異性抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體。所述ZNRD1 蛋白的特異性抗體包括完整的抗體分子、抗體的任何片段或修飾（例如，，嵌合抗體、scFv、 Fab、F(ab'）2、Fv等。只要所述片段能夠保留與ZNRD1蛋白的結(jié)合能力即可。用于蛋白質(zhì) 水平的抗體的制備時(shí)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且本發(fā)明可以使用任何方法來(lái)制備所述抗 體。
[0021] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述檢測(cè)ZNRD1基因 mRNA的引物包括SEQ ID N0. 11 和SEQ ID NO. 12所示的引物對(duì)。
[0022] 本發(fā)明還提供了 ZNRD1基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物的促進(jìn)劑在制備治療顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的 藥物中的應(yīng)用。
[0023] 所述促進(jìn)劑包括促進(jìn)ZNRD1基因表達(dá)的試劑和促進(jìn)ZNRD1基因表達(dá)產(chǎn)物的試 劑；所述促進(jìn)ZNRD1基因表達(dá)的試劑包括促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的試劑、促進(jìn)基因翻譯的試劑、促進(jìn) ZNRD1蛋白含量的試劑；所述促進(jìn)ZNRD1基因表達(dá)產(chǎn)物的試劑包括促進(jìn)ZNRD1基因表達(dá)產(chǎn) 物穩(wěn)定性的試劑、促進(jìn)ZNRD1基因表達(dá)產(chǎn)物活性的試劑、促進(jìn)ZNRD1基因表達(dá)產(chǎn)物功能的試 劑。
[0024] 具體地，所述促進(jìn)ZNRD1基因表達(dá)的試劑包括：含有ZNRD1基因的試劑、攜帶 ZNRD1基因的載體或宿主細(xì)胞所形成的試劑、含有ZNRD1蛋白質(zhì)的試劑。
[0025] 本發(fā)明的促進(jìn)劑一方面可以用于補(bǔ)充內(nèi)源性的ZNRD1蛋白的缺失或不足，通過提 尚ZNRD1蛋白的表達(dá)，從而治療因 ZNRD1蛋白缺之導(dǎo)致的盧頁(yè)內(nèi)動(dòng)脈瘤。另一方面可以用于 促進(jìn)ZNRD1蛋白的活性或者功能，從而治療顱內(nèi)動(dòng)脈瘤。
[0026] 本發(fā)明所述攜帶基因的載體是本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體、包括質(zhì)粒、 粘粒、噬菌體、病毒等。
[0027] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的 例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物 細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CH0細(xì)胞、C0S細(xì)胞等。
[0028] 本發(fā)明還提供了一種用于治療顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的藥物組合物，所述藥物組合物包括上 面所述的ZNRD1基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物的促進(jìn)劑。
[0029] 進(jìn)一步，本發(fā)明的藥物還包括藥學(xué)上可接受的載體，載體，這類載體包括（但并不 限于）：稀釋劑、賦形劑如水等、填充劑如淀粉、蔗糖等；粘合劑如纖維素衍生物、藻酸鹽、明 膠和聚乙烯吡咯烷酮；濕潤(rùn)劑如甘油；崩解劑如瓊脂、碳酸鈣和碳酸氫鈉；吸收促進(jìn)劑季銨 化合物；表面活性劑如十六烷醇；吸附載體如高嶺土和皂粘土；潤(rùn)滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣 和鎂、聚乙二醇等。
[0030] 本發(fā)明的藥物導(dǎo)入組織或者細(xì)胞的方式可以分為體外或者體內(nèi)的方式。體外方 式包括將含有ZNRD1基因的藥物或者含有ZNRD1蛋白質(zhì)的藥物導(dǎo)入細(xì)胞中，再將細(xì)胞移植 或回輸?shù)襟w內(nèi)。體內(nèi)方式包括直接將含有ZNRD1基因的藥物或者含有ZNRD1蛋白質(zhì)的藥物 注入體內(nèi)組織中。
[0031] 本發(fā)明的藥物還可與其他治療顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的藥物聯(lián)用，多種藥物聯(lián)合使用可以大 大提到治療的成功率。
[0032] 在本發(fā)明的上下文中，"ZNRD1基因"包括ZNRD1基因以及ZNRD1基因的任何功能 等同物的多核苷酸。ZNRD1基因包括與目前國(guó)際公共核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)