用于制備含n-乙酰乳糖胺的四糖乳糖-n-新四糖(lnnt)的方法
【專利說明】用于制備含N-乙釀乳糖胺的四糖乳糖-N-新四糖（LNNT) 的方法
[0001] 本申請是國際申請?zhí)朠CT/DK2011/050053,國際申請日2011年2月21日，中國 申請?zhí)?01180009778. 3,發(fā)明名稱為"用于制備含N-乙酰乳糖胺的四糖乳糖-N-新四糖 (LNNT)的方法"的專利申請的分案申請。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及用于制備、尤其是大規(guī)模制備Galpβl_4GlcNAcpβl_3Galpβl_4Glc( LNnT)的方法，以及LNnT的中間體和新晶形（多晶型物）。
【背景技術(shù)】
[0003] 在過去數(shù)十年間，對人乳寡糖（人乳低聚糖，ΗΜ0)的制備和商業(yè)化的興趣持續(xù)增 加。ΗΜ0的重要性直接與其獨特的生物學(xué)活性如抗菌、抗病毒、免疫系統(tǒng)和認(rèn)知發(fā)育增強(qiáng)活 性相關(guān)。
[0004] 四糖Galpβl-4GlcNAcpβl-3Galpβl-4Glc(乳糖-N-新四糖，LNnT，方案 1) 是存在于人乳中的寡糖之一（Kuhn等，Chem.Ber. 1962,95, 513 和 518，KobataMethods Enzymol.l972,28,262]。LNnT充當(dāng)肺炎雙球菌（pneumococci)的細(xì)菌受體并且發(fā)現(xiàn)它可 用于識別糖基轉(zhuǎn)移酶的受體特異性、糖苷酶的底物特異性以及抗原決定簇的結(jié)構(gòu)。此外， LNnT代表具有各種生理活性的糖脂和糖蛋白（擬紅細(xì)胞糖苷酯（paragloboside)、6_唾液 基-LNnT等）中的更復(fù)雜寡糖的核心結(jié)構(gòu)元件。
[0005]
[0006] 迄今，還不可能通過使用分離、生物技術(shù)和合成方法得到大量的LNnT。由于存在大 量類似寡糖，所以即使以毫克量從人乳中分離LNnT也相當(dāng)困難。
[0007] LNnT的酶合成包括在半乳糖基轉(zhuǎn)移酶存在下將乳糖-N-丙糖II用UDP-半乳糖 孵育[Sabesan等J.Am.Chem.Soc. 1986,108, 2068 ;EP-A-870841]或在β-D-半乳糖苷酶存 在下用乳糖孵育[Murata等Glycoconj.J. 1999，16，189;JP10-234394Α]。與固體載體結(jié) 合的合適三糖的酶促半乳糖苷化也作了詳細(xì)描述[Blixt等Carbohydr.Res. 1999,319,80 ; Renaudie等ibid. 2004, 339,693]。這些復(fù)雜的酶促系統(tǒng)代表用于LNnT的大規(guī)模生產(chǎn)的非 常昂貴的方法和困難的純化方案。
[0008] 公開的針對LNnT的總的合成程序[Zurabyan等SovietJ.Bioorg.Chem. 1978,4， 679;Paulsen等Carbohydr.Chem. 1987,169,105;Aly等ibid. 1999, 316,121]包括多個反 應(yīng)步驟、保護(hù)基操作和色譜法純化、低產(chǎn)率，并且僅提供毫克量的LNnT，因此它們對于大規(guī) 模制備沒有提供引人注意的技術(shù)。作為擬紅細(xì)胞糖苷酯的芐基類似物的1-0-苯基-LNnT 的合成也已公開[Ponpipom等TetrahedronLett. 1978, 20,1717]〇
[0009] 當(dāng)從天然來源分離[Kuhn等Chem.Ber. 1962,95, 513]或通過酶方法 [EP-A-1405856]制備時，LNnT被表征為晶體物質(zhì)。
[0010] 對于LNnT和用于它的中間體，仍然需要可以簡化迄今為止想到的分離、純化和制 備問題的晶體產(chǎn)品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的第一方面涉及一種用于制備Galpβl_4GlcNAcpβl_3Galpβl_4Glc(LN ηΤ)的方法，所述方法包括以下步驟：
[0012] a)使由通式5表征的供體
[0013]
[0014] 其中R4是任選取代的?；?，
[0015] _冊51?6選自-熟(32、-順-鹵代?；?、苯鄰二甲酰亞胺、四氯苯鄰二甲酰亞胺、2,3-二 苯基馬來酰亞胺和2, 3-二甲基馬來酰亞胺，
[0016] X選自鹵素、_0C( =NH)CC13、-OAc、-OBz和-SR7，其中馬選自烷基和任選取代的 苯基，
[0017] 與通式6的受體發(fā)生反應(yīng)
[0018]
[0019] 其中&是通過催化氫解可去除的基團(tuán)，
[0020] r2是任選取代的?；?br>[0021] 私選自任選取代的?；騂，
[0022] 從而產(chǎn)生通式4的化合物
[0023]
[0024] 其中&、R2、R3、心和-NR5R6是如上所定義的，
[0025] b)將通式4的化合物轉(zhuǎn)化為通式1的化合物
[0026]
[0027] 其中札是如上所定義的，
[0028]c)使所述通式1的化合物結(jié)晶，以及
[0029] d)隨后使所述通式1的化合物經(jīng)過催化還原。
[0030] 本發(fā)明的第二方面提供GalpPl-4GlcNAcp0l-3Galp0l-4Glc(LNnT)的一種多 晶型物。
[0031] 本發(fā)明的第三方面涉及GalpPl-4GlcNAcp0l-3Galp0l-4Glc(LNnT)的多晶型 物，其用作藥物試劑。
[0032] 本發(fā)明的第四方面提供GalpPl_4GlcNAcp0l_3Galp0l_4Glc(LNnT)的多晶型 物，其用作營養(yǎng)添加劑。
[0033] 本發(fā)明的第五方面涉及一種藥物組合物，所述藥物組合物包含 GalpPl-4GlcNAcp0l-3Galp0l-4Glc的多晶型物。
[0034] 本發(fā)明的第六方面提供一種營養(yǎng)組合物，所述營養(yǎng)組合物包含 GalpPl-4GlcNAcp0l-3Galp0l-4Glc的多晶型物。
[0035] 本發(fā)明的第七方面涉及通式Γ的化合物
[0036]
[0037] 其中R\選自取代芐基，任選取代的二苯甲基，任選取代的三苯甲基和任選取代的 萘甲基。
[0038] 本發(fā)明的第八方面提供通式2'的化合物
[0039]
[0040] 其中R\選自取代芐基，任選取代的二苯甲基，任選取代的三苯甲基和任選取代的 萘甲基。
[0041] 本發(fā)明的第九方面涉及通式3的化合物
[0042]
[0043] 其中&選自任選取代的芐基，任選取代的二苯甲基，任選取代的三苯甲基和任選 取代的萘甲基，而_NR5R6選自-NH-鹵代?；?，苯鄰二甲酰亞胺，四氯苯鄰二甲酰亞胺，2， 3-二苯基馬來酰亞胺和2, 3-二甲基馬來酰亞胺。
[0044] 本發(fā)明的第十方面提供通式4'的化合物
[0045]
[0046] 其中&選自任選取代的芐基，任選取代的二苯甲基，任選取代的三苯甲基和任 選取代的萘甲基，并且私和R4各自獨立地是任選取代的?；琑3選自任選取代的?；?!1，-冊51?6選自-熟〇 2，-順-鹵代酰基，四氯苯鄰二甲酰亞胺，2,3-二苯基馬來酰亞胺和2， 3-二甲基馬來酰亞胺。
[0047] 本發(fā)明的第十一方面涉及通式4a的化合物
[0048]
[0049] 其中&選自任選取代的芐基，任選取代的二苯甲基，任選取代的三苯甲基和任選 取代的萘甲基。
[0050] 本發(fā)明的第十二方面提供通式5'的化合物
[0051]
[0052] 其中R4是任選取代的醜基，優(yōu)選乙醜基，-NR5R6是-NH- 1?代醜基，優(yōu)選-NH-二氣 乙?；?NH-三氟乙?；⑶襌7是任選取代的苯基，優(yōu)選苯基。
[0053] 本發(fā)明的第十三方面涉及通式6'的化合物
[0054]
[0055] 其中&選自任選取代的芐基，任選取代的二苯甲基，任選取代的三苯甲基和任選 取代的萘甲基，私是任選取代的苯甲?；?，并且1? 3選自任選取代的酰基和H。
【附圖說明】
[0056] 下文中將參考附圖進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明，其中：
[0057] 圖1顯示根據(jù)實施例34制備的晶體LNnT的X射線粉末衍射圖。
[0058] 圖2顯示根據(jù)34和EP-A-1405856制備的晶體LNnT的X射線粉末衍射圖的比較 (連續(xù)曲線：根據(jù)實施例34制備的晶體LNnT的衍射圖；垂直線：取自EP-A-1405856的數(shù) 據(jù)）。
[0059] 圖3顯示根據(jù)實施例34制備的晶體LNnT的固態(tài)13C_NMR譜圖。
【具體實施方式】
[0060] 在本說明書通篇中，術(shù)語"烷基"，單獨地或與另一種原子或基團(tuán)連接時，指具有 1-6個碳原子的直鏈或支鏈烴基，如甲基、乙基、正丙基、異丙基、1 丁基、異丁基、仲丁基、叔 丁基等。
[0061] 在本申請中，術(shù)語"芳基"指同芳香性基團(tuán)如苯基或萘基。優(yōu)選地，芳基指苯基。
[0062] 在本說明書中，術(shù)語"?；?表示R-C( = 0)_，其中R可以是H、烷基或芳基，如甲 ?；⒁阴；⒈；⒍□；?、新戊酰基、苯甲?；?。所述烷基和芳基殘基都可以被取代。 [0063] 對于本說明書及權(quán)利要求的目的，術(shù)語"任選取代的"指目標(biāo)基團(tuán)可以帶有取代基 或可以是未被取代的。
[0064] 對于本說明書及權(quán)利要求的目的，術(shù)語"取代的"指目標(biāo)基團(tuán)被通常改變鏈或環(huán)的 總體化學(xué)特性的基團(tuán)取代。取代基可以被用于改變分子作為整體的性質(zhì)，如穩(wěn)定性、可溶性 和形成晶體的能力。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道可以在給定情形下用作備選方案的具有相似大 小和電荷特性的其他合適取代基。
[0065] 更通常地，與術(shù)語"烷基"、"芳基"和"酰基"結(jié)合時，術(shù)語"任選取代的"意在表示 目標(biāo)基團(tuán)可以被選自以下的基團(tuán)取代一次或多次，優(yōu)選1-5次，更優(yōu)選1-3次：烷基（僅對 芳基和芳族?；⒘u基、烷氧基（即烷基-氧基）、羧基、氧代（形成酮或醛官能度）、烷氧 基幾基、烷基幾基、甲醜基、芳基、芳氧基幾基、芳氧基、芳基氣基、芳基幾基、氣基、單和^?燒 基氣基、氣基甲醜基、單和^烷基 _氣基幾基、烷基幾基氣基、氛基、燒醜氧基、硝基、燒硫基 和鹵素（F、Cl、Br、I)。
[0066] 表述"通過催化氫化可去除的基團(tuán)"指這樣的基團(tuán)，所述基團(tuán)的C-0鍵在已知 用于氫解的催化量鈀、阮內(nèi)鎳或另一種適當(dāng)金屬催化劑存在下通過加入氫而裂解，導(dǎo)致 產(chǎn)生0H基團(tuán)。此類基團(tuán)是技術(shù)人員熟知的并且被充分討論的[例如P.G.M.Wuts和 T.W.Greene〖ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis(有機(jī)合成中的保護(hù)基團(tuán)），John Wiley&Sons(2007)]。合適的基團(tuán)包括芐基、二苯基甲基（二苯甲基）、1-萘甲基、2-萘甲 基或三苯基甲基（三苯甲基），它們各自可以被選自以下的一個或多個基團(tuán)任選取代：烷 基、烷氧基、苯基、氣基、醜基氣基、烷基氣基、^烷基氣基、硝基、駿基、烷氧基幾基、氣基甲 ?；?、N-烷基氨基甲?；?、N，N-二烷基氨基甲?；?、疊氮基、鹵代烷基或鹵素。優(yōu)選地，如 果存在，這樣的取代在芳環(huán)上。尤其優(yōu)選的保護(hù)基是被選自烷基或鹵素的一個或多個基團(tuán) 任選取代的芐基。更優(yōu)選地，保護(hù)基選自未取代的芐基、4-氯芐基和4-甲基芐基。這些尤 其優(yōu)選的和更優(yōu)選的保護(hù)基的優(yōu)勢在于：氫解的副產(chǎn)物只有甲苯或取代甲苯。即使在數(shù)噸 規(guī)模中，這樣的副產(chǎn)物也可以經(jīng)由蒸發(fā)和/或萃取過程容易地從水溶性寡糖產(chǎn)物中除去。 [0067] 結(jié)合基團(tuán)_NR5R6中的-NH-鹵代?；g(shù)語"鹵代?；?指式CnHxXy_C( = 0)-的鹵 代醜基，其中整數(shù)η是1、2或3,x+y= 2n+l，前提是X<y，并且X是F、C1和Br，如二氣乙 ?；?、三氯乙?；?、三氟乙?；?、七氟丁?；取?br>[0068] 本發(fā)明代表一種適用于LNnT的大規(guī)模制備的商業(yè)方法，即典型地用制備成批的 至少lkg的LNnT，如至少5kg，或至少50kg，或甚至至少200kg，例如至少1噸的LNnT。成功 的策略是基于引入相關(guān)的允許簡單且可靠的純化方法的晶體中間體。結(jié)晶或再結(jié)晶是從污 染物分離產(chǎn)物并獲得純物質(zhì)的最簡單和廉價的方法之一。此外，在產(chǎn)品開發(fā)中，提供固體的 一種或多種晶體變體（多晶型物）是一個重要的因素，因為不同的晶形不同地影響化合物 的性質(zhì)，例如熱力學(xué)穩(wěn)定性、可溶性、密度、吸濕性、電性質(zhì)（如介電常數(shù)，電導(dǎo)率）、機(jī)械性 質(zhì)（如易碎性、硬度、抗斷強(qiáng)度、彈性）、光學(xué)性質(zhì)（如顏色、透明度、折射）等。它擴(kuò)大了科 學(xué)人員擁有的可用于改善產(chǎn)品特性的物質(zhì)的技能。
[0069] 本發(fā)明在第一方面提供了用于制備GalpPl_4GlcNAcp0l_3Galp0l-4Glc的方 法，所述方法包括以下步驟：
[0070] a)使由通式5表征的供體
[0071]
[0072] _冊51?6選自-熟(32，-順-鹵代?；洁彾柞啺?，四氯苯鄰二甲酰亞胺，2,3-二 苯基馬來酰亞胺和2, 3-二甲基馬來酰亞胺，
[0073] X選自鹵素，_0C( =NH)CC13, -OAc，-OBz和_SR7，其中馬選自烷基和任選取代的 苯基，
[0074] 與通式6的受體反應(yīng)
[0075]
[0076] 其中&是通過催化氫解可去除的基團(tuán)，
[0077] R2是任選取代的?；⑶?br>[0078] R3選自任選取代的酰基或H，
[0079] 從而產(chǎn)生通式4的化合物
[0080]
[0081] 其中&、R2、R3、心和_NR5R6是如上所定義的，
[0082] b)將通式4的化合物轉(zhuǎn)化為通式1的化合物
[0083]
[0084] 其中札是如上所定義的，
[0085] c)使通式1的化合物結(jié)晶，以及
[0086] d)隨后使通式1的化合物經(jīng)過催化還原。
[0087] 關(guān)于步驟a)，根據(jù)通式4的經(jīng)充分保護(hù)的LNnT衍生物在糖基化條件下在通式5的 化合物（供體）與通式6的化合物（受體）的反應(yīng)中合成。
[0088] 通式6的乳糖受體與通式5的乳糖氨基供體的偶聯(lián)可以在活化劑（促進(jìn)劑或催化 劑）的存在下在非質(zhì)子溶劑或非質(zhì)子溶劑的混合物中進(jìn)行以導(dǎo)致所需的糖基化產(chǎn)物。新的 糖苷間鍵合通過以下方式形成：用根據(jù)通式6的受體的3' -0H基團(tuán)親核取代根據(jù)通式5的 供體的離去基團(tuán)X。兩個參與反應(yīng)的反應(yīng)物中的其他官能團(tuán)需要用保護(hù)基屏蔽。此外，本發(fā) 明的發(fā)明人意識到區(qū)域選擇性糖基化可以在其中私是Η的通式6的受體上實現(xiàn)。在這樣的 二羥基受體中，平伏的3'-0Η和軸向的4'-0Η的反應(yīng)性是不同的：平伏的0Η基團(tuán)在糖基化 條件下可以充當(dāng)更強(qiáng)的親核體。因此，通過仔細(xì)地選擇條件如供體反應(yīng)性、溶劑、溫度、促進(jìn) 劑性質(zhì)、反應(yīng)物/促進(jìn)劑的添加方式等，可以推動反應(yīng)以形成所需的1-3糖苷間鍵合而不是 1-4偶聯(lián)。對于立體選擇性尤其需要注意。立體化學(xué)結(jié)果可能受到諸如以下的不同因素影 響：供體C-2處是否存在參與基團(tuán)，離去基團(tuán)X的性質(zhì)，溶劑效應(yīng)，供體和受體兩者上的保護(hù) 基的性質(zhì)，促進(jìn)劑或催化劑的性質(zhì)，溫度，壓力，供體和受體之間的空間相互作用等。在葡糖 氨基或乳糖氨基衍生物的情況中，開發(fā)了一系列糖基化的異頭活化并且其對于糖化學(xué)領(lǐng)域 技術(shù)人員是可用的。這些方法通過綜述和手冊被廣泛討論，例如Demchenko(Ed. ):Handbook ofChemicalGlycosylation(化學(xué)糖基化手冊），Wiley(2008)。為了實施例，取決于X基 團(tuán)，以下簡要提及一些總的考慮。
[0089] 糖基鹵化物（X指F、Cl、Br、I)經(jīng)常被用于糖基化反應(yīng)，原因在于其容易的可及性 和令人滿意的反應(yīng)性。典型地，對于親核取代，異頭鹵化物遵循F<Cl<Br<I的反應(yīng)性 次序。糖基化反應(yīng)通常通過重金屬離子，主要是汞或銀，以及路易斯酸促進(jìn)。
[0090] 糖基三氯乙酰亞胺酯（X= -oc( =NH)CC13)可以容易地通過在無機(jī)或有機(jī)堿催 化下將游離的異頭0H添加到三氯乙腈來制備。在典型的糖基化反應(yīng)中，催化量的路易斯酸 如三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸鹽或bf3-醚合物促進(jìn)偶聯(lián)。
[0091] 糖基化反應(yīng)中的糖基乙酸酯或苯甲酸酯（X表示-OAc或-0BZ)首先經(jīng)歷親電子活 化，提供反應(yīng)性中間體，然后用親核0H受體處理。選擇的典型活化劑是布朗斯臺德酸（如 TsOH、HC104、氨基磺酸）、路易斯酸（如ZnCl2、SnCl4、三氟甲磺酸鹽、BF3-醚合物、三苯甲基 高氯酸鹽、A1C13、三氟甲磺酸酐）和它們的混合物。
[0092] 硫苷（X表示烷硫基或苯硫基）可以由