Ace抑制肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及ACE抑制肽及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】：
[0002] 近年來越來越多的研究表明來源于天然食物或動植物的生物活性肽對人體健康 有著積極的作用。這些生物活性肽能夠通過調(diào)節(jié)人體內(nèi)各種生理過程從而對人體產(chǎn)生有益 的影響。目前有關(guān)生物活性肽的生理功效已被廣泛研究，其免疫調(diào)節(jié)、抗高血壓、抗氧化、保 護(hù)骨骼以及抗高血脂等一系列重要作用相繼見諸報道，在這其中生物活性肽的抗高血壓作 用是目前研究最為廣泛也是最具應(yīng)用價值的用途之一。
[0003] 高血壓是指人在安靜狀態(tài)下舒張壓（DiastolicBloodPressure，DBP)/收縮壓 (SystolicBloodPressure，SBP)持續(xù)高于 140/90mmHg，其平均發(fā)病率在 15 ~20 % 之 間。作為全球最常見的慢性病，高血壓可以誘發(fā)心血管病、中風(fēng)以及腎臟病等多種疾病， 甚至造成無數(shù)患者死亡。相關(guān)研究表明人體血壓受到多種因素調(diào)節(jié)，其中血管緊張素系統(tǒng) (renin-angiotensinsystem，RAS)和激肽系統(tǒng)（kallikreinkininsystem，KKS)是人體 控制血壓穩(wěn)定的主要方式。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（Angiotensinconvertingenzyme，ACE) 在這兩個系統(tǒng)中的作用尤其重要。在RAS系統(tǒng)中，ACE控制著沒有生理活性的血管緊張素 I(AngiotensinI，AngI)向具有升壓活性的血管緊張素II(AngiotensinII，AngII) 的轉(zhuǎn)化。在KKS系統(tǒng)中，ACE可通過失活血管舒緩激肽，導(dǎo)致血管收縮，引起血壓升高。因 此，ACE是抗高血壓藥物最重要的靶標(biāo)之一。研究表明具有抗高血壓作用的生物活性肽能 夠通過抑制ACE來實現(xiàn)降血壓功效。且相比傳統(tǒng)降壓藥物這些天然活性肽具有特異性高、 毒副作用小、易吸收、藥效持續(xù)時間長等優(yōu)點。
[0004] 目前已報道具有ACE抑制和抗高血壓作用的生物活性肽已有數(shù)百種，其來源十分 廣泛，包含了動物、植物以及乳制品等不同來源。但是，從動植物及乳制品中分離提純生物 活性肽具有步驟繁瑣、成本較高且無法大規(guī)模研究等缺點。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005] 本發(fā)明的第一個目的是提供對ACE(血管緊張素轉(zhuǎn)化酶）的活性具有持續(xù)穩(wěn)定的 抑制作用，具有良好降血壓效果的ACE抑制肽。
[0006] 本發(fā)明是利用人工合成技術(shù)對長度為2個氨基酸的短肽的ACE抑制活性進(jìn)行系統(tǒng) 地評價，篩選具有高ACE抑制率的二肽，并進(jìn)一步研究其在動物體內(nèi)的降血壓效果。相較傳 統(tǒng)抗高血壓藥物，生物活性肽具有具有毒副作用小、更加安全的優(yōu)勢。因此，本發(fā)明將對抗 高血壓新藥物和保健食品的開發(fā)等具有重要意義。
[0007] 本發(fā)明的ACE抑制肽，其氨基酸序列為Cl(Cys-Ile)或CK(Cys-Lys)。
[0008] 本發(fā)明的第二個目的是提供上述ACE抑制肽在制備ACE抑制藥物中的應(yīng)用。
[0009] -種ACE抑制藥物，其含有上述ACE抑制肽作為活性成份。
[0010] 本發(fā)明的第三個目的是提供上述ACE抑制肽在制備降血壓藥物中的應(yīng)用。
[0011] -種降血壓藥物，其含有上述ACE抑制肽作為活性成份。
[0012] 本發(fā)明的二肽CI或CK對ACE的活性具有持續(xù)穩(wěn)定的抑制作用，并經(jīng)動物試驗發(fā) 現(xiàn)，二肽CI在大鼠體內(nèi)具有良好的降血壓效果，為合成高血壓治療藥物提供參考。
【附圖說明】：
[0013] 圖1是34種二肽的ACE的抑制率；
[0014] 圖2是二肽CI和CK的ACE抑制活性；
[0015] 圖3是CI灌胃后2小時SHR大鼠血壓改變情況。血壓變化數(shù)據(jù)以"平均值土標(biāo) 準(zhǔn)誤"形式表示。*P〈〇. 05, **p〈0. 01表示給藥前后血壓值發(fā)生顯著變化；
[0016] 圖4是CI灌胃后4小時SHR大鼠血壓改變情況。血壓變化數(shù)據(jù)以"平均值土標(biāo) 準(zhǔn)誤"形式表示。*P〈〇. 05, **p〈0. 01表示給藥前后血壓值發(fā)生顯著變化。
【具體實施方式】：
[0017] 以下實施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0018] 實施例1 :
[0019] 1.實驗部分
[0020] 1. 1實驗材料和儀器
[0021] 實驗材料：合成二肽（由吉爾生化上海有限公司合成）如表1所示，純度 大于95%，共34種；卡托普利（Captoril)西格瑪奧德里奇公司；呋喃丙烯酰三肽 (FAPhe-Gly-Gly，F(xiàn)APGG)西格瑪奧德里奇公司純度> =98%;ACE西格瑪奧德里奇公司；原 發(fā)性高血壓大鼠（SpontaneouslyHypertensiveRats，SHR)雄性31周齡北京維通利華實 驗動物技術(shù)有限公司動物許可證號：SCXK(京）2012-0001飼養(yǎng)一周適應(yīng)環(huán)境后按每5只一 組進(jìn)行分組；生理鹽水。
[0022] 儀器設(shè)備：VICTORX多標(biāo)記酶標(biāo)儀酶標(biāo)儀鉑金埃爾默公司；移液器法國吉爾森公 司；BP-98A智能無創(chuàng)血壓儀北京軟隆生物技術(shù)有限公司；注射器；灌胃針。
[0023]
[0024]
[0025] 1· 2實驗方法：
[0026] 1· 2. 1ACE抑制率的測定
[0027] 二肽的ACE抑制率使用可見分光光度法進(jìn)行測定。具體方法是利用FAPGG作為ACE 作用的底物，F(xiàn)APGG最大吸收峰在340nm附近，用ACE將FAPGG水解成FAP和GG可使340nm 附近處吸光度降低，降低的速率與ACE活性成正比。通過測定FAPGG在340nm附近處吸光 度下降速度可計算出ACE的活性，進(jìn)而根據(jù)添加抑制劑前后ACE酶活的變化間接反映不同 ACE抑制劑的抑制活性。本實驗將二肽樣本用超純水溶解后配置20mg/mL原液，然后稀釋成 20μg/mL濃度的樣品作為實驗組，以0. 0002μg/mL的卡托普利溶液為陽性對照，以生理鹽 水為陰性對照。實驗于37°C下，以340nm為主波長檢測ACE底物FAPGG的吸光度，405nm為 參比波長消除噪音影響，檢測吸光度值的變化，檢測以3分鐘為間隔連續(xù)檢測1小時。根據(jù)
其中E為樣品孔的ACE酶活（U/L)，計
SsS樣品孔ACE動力學(xué)曲線直線段的斜率，Sp為未加抑制劑孔 的ACE動力學(xué)曲線直線段的斜率，Sb為空白孔ACE動力學(xué)曲線直線段的斜率。
[0028] 1. 2. 2IC5。測定
[0029] 實驗將二肽原液稀釋成200yg/mL濃度的樣品作為試樣，以20yg/L濃度的 Captopril樣品作為陽性對照，對各樣品按3濃度倍梯度進(jìn)行稀釋，后按1. 2. 1所述方法測 定樣品的ACE抑制率，進(jìn)而計算IC50值。
[0030] 1.2. 3大鼠降壓實驗
[0031] 購買31周齡的原發(fā)性高血壓大鼠，飼養(yǎng)一周適應(yīng)環(huán)境后進(jìn)行分組實驗。按照如 下劑量：卡托普利（l〇〇mg/kg)、生理鹽水、CI(100mg/kg、50mg/kg、25mg/kg、10mg/kg、lmg/kg)將相應(yīng)藥品溶于生理鹽水中利用灌胃方式進(jìn)行給藥。利用無創(chuàng)血壓儀分別測量大鼠灌 胃前、灌胃后2小時、灌胃后4小時后的舒張壓（DiastolicBloodPressure，DBP)、收縮壓 (SystolicBloodPressure，SBP)和平均動脈壓（MeanBloodPressure，MBP)，取其平均值 作為相應(yīng)的血壓值。
[0032] 1. 2. 4統(tǒng)計分析
[0033] 數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用R進(jìn)行兩樣本均值單尾t檢驗，數(shù)值均以均值土標(biāo)準(zhǔn)誤表示。
[0034] 2.結(jié)果與討論
[0035] 2. 1 34種二肽的ACE抑制率
[0036] 本研究用可見光分光光度法連續(xù)監(jiān)測34種二肽在一小時內(nèi)對ACE的抑制活性，表 1中的34種二肽均為人工合成，純度在95%以上（表1)。測試結(jié)果發(fā)現(xiàn)N端為半胱氨酸 (Cys，C)的兩種二肽半胱氨酸-異亮氨酸（Cys-Ile，CI)和半胱氨酸-賴氨