一種丙型肝炎病毒重組蛋白的制備及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種丙型肝炎病毒重組蛋白的 制備及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 丙型肝炎病毒（HepatitisCvirus,HCV)感染是導(dǎo)致人類肝硬化、肝癌的主要誘 因之一，在世界范圍內(nèi)有約170, 000, 000人感染，感染率高達(dá)3%，極大威脅著人類的健康。 目前對于丙型肝炎病毒，尚無預(yù)防性或治療性疫苗可用。
[0003] 隨著臨床研究的深入，越來越多的證據(jù)表明中和抗體在HCV感染的控制、清除過 程中起著重要的作用。在病人體內(nèi)，中和抗體的快速誘導(dǎo)，中和抗體的滴度、廣度與HCV感 染的清除直接相關(guān)。無論黑猩猩實驗還是病人臨床樣本分析均顯示，在HCV急性感染過程 中，快速誘導(dǎo)出的中和抗體可以有效控制和清除HCV感染；而在慢性感染病人體內(nèi)，如果 在感染早期沒有誘導(dǎo)出高滴度中和抗體，即便晚期體內(nèi)誘導(dǎo)出中和抗體，也無法控制病毒 的持續(xù)感染。因此，誘導(dǎo)高滴度的中和抗體反應(yīng)是早期HCV疫苗研發(fā)的一個重要指標(biāo)。然 而，由于HCV本身的高度變異性、血清中脂蛋白成分的包裹、糖基化對中和位點(diǎn)的掩護(hù)以及 干擾抗體的作用等原因，早期HCV候選疫苗所產(chǎn)生的抗體往往只對相同亞型病毒有中和效 果，不具有廣譜性。
[0004] 因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)能夠誘導(dǎo)針對所有或大多數(shù)亞型病毒的廣譜中和抗 體，以便用于開發(fā)HCV預(yù)防性疫苗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種丙型肝炎病毒重組蛋白的制備及其應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的第一方面，提供了一種分離的HCV抗原肽，所述抗原肽源自HCV病毒的E2 蛋白（尤其是E2蛋白的胞外區(qū)），并且所述抗原肽的長度為200-350個氨基酸，并且所述抗 原肽可結(jié)合于抗HCV的抗體。
[0007] 在另一優(yōu)選例中，所述HCV病毒為HCVlb型病毒；優(yōu)選地，為Coni毒株。
[0008] 在另一優(yōu)選例中，所述的抗原肽具有誘導(dǎo)廣譜中和抗體的能力，所述廣譜中和抗 體可結(jié)合于選自下組的至少6種或全部HCV毒株：Coni,PR52,PR79L9,JFH1，S52,HK6a，H77/ JFH1,Conl/JFHl,J6/JFH1,PR26,PR79L9,J8/JFH1,S52/JFH1,ED43/JFH1,PR26C3mt,SA13/ JFH1,HK6a/JFHl和QC69/JFH1。
[0009] 在另一優(yōu)選例中，所述的抗原肽與受體SR-BI的結(jié)合活性A1與相應(yīng)野生型E2蛋 白與受體SR-ΒΙ的結(jié)合活性的B1的比值A(chǔ)1/B1彡0. 7,較佳地彡0. 5,更佳地彡0. 2。
[0010] 在另一優(yōu)選例中，所述的抗原肽選自下組：
[0011] ⑷具有SEQIDN0:5、SEQIDN0. :3、SEQIDN0. :4 或SEQIDN0. :2 所示氨基 酸序列的多肽；
[0012] (B)具有㈧中任一所示氨基酸序列彡80%同源性（優(yōu)選地，彡90%的同源性； 等優(yōu)選地彡95 %的同源性；最優(yōu)選地，彡97 %的同源性）的多肽，且所述多肽具有與抗HCV的抗體的結(jié)合能力；
[0013] (C)將SEQIDN0:2-5中任一所示氨基酸序列經(jīng)過1-5個氨基酸殘基的取代、缺失 或添加而形成的，且保留與抗HCV抗體結(jié)合能力的衍生多肽。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述的抗HCV抗體包括抗HCV野生型E2蛋白抗體，其中包括抗 血清、或抗HCV野生型E2蛋白的對應(yīng)區(qū)域的單克隆抗體。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述的抗原肽選自下組：SEQIDN0:5、SEQIDN0. :3、SEQID NO. : 4、SEQIDNO. :2 或其組合。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述抗原肽采用化學(xué)合成或生物工程方法獲得，包括重組蛋白、 融合蛋白。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述的抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體或抗血清。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述的E2蛋白包括野生型和突變型的E2序列。
[0019] 本發(fā)明的第二方面，提供了一種融合蛋白，所述融合蛋白含有本發(fā)明第一方面所 述的抗原肽和任選的標(biāo)簽序列和/或連接序列。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述標(biāo)簽序列為6His序列。
[0021] 本發(fā)明的第三方面，提供了一種分離的多核苷酸，所述的多核苷酸編碼本發(fā)明第 一方面所述的抗原肽或本發(fā)明第二方面所述的融合蛋白。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述多核苷酸選自下組：
[0023] (a)編碼如SEQIDN0. : 2-5所示多肽的多核苷酸；
[0024] (b)序列如SEQIDNO. :9、SEQIDNO. :8、SEQIDN0. :7 或SEQIDN0. :6 所示的 多核苷酸；
[0025] (c)核苷酸序列與（b)所示序列的同源性彡95% (較佳地彡98% )的多核苷酸；
[0026] (d)如（b)所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短或添加1-60個（較佳地1-30， 更佳地卜1〇個）核苷酸的多核苷酸；
[0027] (e)與（a)-(d)任一所述的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。
[0028] 本發(fā)明的第四方面，提供了 一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體含有本發(fā)明第三方面所 述的多核苷酸。
[0029] 本發(fā)明的第五方面，提供了一種宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞含有本發(fā)明第四方面 所述的表達(dá)載體，或者在基因組中整合有本發(fā)明第三方面所述的多核苷酸。
[0030] 在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。
[0031] 在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞包括果蠅S2細(xì)胞、大腸桿菌、酵母、CH0細(xì)胞、DC 細(xì)胞等。
[0032] 本發(fā)明的第六方面，提供了一種藥物組合物，所述的藥物組合物含有本發(fā)明第一 方面所述的抗原肽、本發(fā)明第二方面所述的融合蛋白、本發(fā)明第三方面所述的多核苷酸、本 發(fā)明第四方面所述的表達(dá)載體或者本發(fā)明第五方面所述的宿主細(xì)胞，以及藥學(xué)上可接受的 載體和/或輔料。
[0033] 在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物為疫苗。
[0034] 本發(fā)明的第七方面，提供了一種疫苗組合物，所述的疫苗組合物含有本發(fā)明第一 方面所述的抗原肽、本發(fā)明第二方面所述的融合蛋白、本發(fā)明第三方面所述的多核苷酸、本 發(fā)明第四方面所述的表達(dá)載體或者本發(fā)明第五方面所述的宿主細(xì)胞，以及免疫學(xué)上可接受 的載體和/或輔料。
[0035] 在另一優(yōu)選例中，所述的疫苗組合物還含有佐劑。
[0036] 在另一優(yōu)選例中，所述的佐劑包括氧化鋁、皂苷、quilA、胞壁酰二肽、礦物油或 植物油、基于囊泡的佐劑、非離子嵌段共聚物或DEAE葡聚糖、細(xì)胞因子（包括IL-1、IL-2、 IFN-r、GM-CSF、IL-6、IL-12 和CpG)。
[0037] 在另一優(yōu)選例中，所述佐劑選自：鋁佐劑、鋁佐劑混合CpG、和弗氏佐劑。
[0038] 本發(fā)明的第八方面，提供了本發(fā)明第一方面所述的抗原肽、本發(fā)明第二方面所述 的融合蛋白、本發(fā)明第三方面所述的多核苷酸、本發(fā)明第四方面所述的表達(dá)載體或者本發(fā) 明第五方面所述的宿主細(xì)胞的用途，
[0039] (a)用于制備針對所述抗原肽的抗體；和/或
[0040] (b)用于制備治療或預(yù)防HCV感染相關(guān)疾病的藥物；和/或
[0041] (c)用于制備檢測HCV的試劑或試劑盒；和/或
[0042] (d)用于檢測抗HCV的抗體。
[0043] 在另一優(yōu)選例中，所述的"檢測HCV的試劑或試劑盒"包括檢測片、檢測板、蛋白芯 片、液基芯片、磁珠。
[0044] 在另一優(yōu)選例中，所述抗HCV抗體為人體液樣品中的抗HCV抗體。優(yōu)選地，所述體 液是血液或唾液。
[0045] 本發(fā)明的第九方面，提供了一種免疫檢測試劑盒，所述試劑盒包括本發(fā)明第一方 面所述的用于檢測抗HCV抗體的抗原肽。
[0046] 在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒中可以包括一種或多種本發(fā)明第一方面所述的用于 檢測抗HCV抗體的抗原肽。
[0047] 在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還包括載體，所述的抗原肽包被在所述載體上。
[0048] 在另一優(yōu)選例中，所述免疫檢測試劑盒還包括標(biāo)記的抗HCV抗體的二抗。二抗用 來檢測人血清中的抗體IgG，IgM，或IgA.所用標(biāo)記物可以是辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶， 熒光分子FITC(或其它熒光標(biāo)記），化學(xué)發(fā)光檢測。檢測方法可以是顯色法，熒光方法，化學(xué) 發(fā)光，電化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行定性、定量分析。
[0049] 在另一優(yōu)選例中，所述的二抗是辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗。
[0050] 本發(fā)明的第十方面，提供了一種本發(fā)明第一方面所述的抗原肽的制備方法，包括 以下步驟：
[0051] (a)培養(yǎng)本發(fā)明第四方面所述的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)出本發(fā)明第一方面所述的抗 原肽；
[0052] (b)分離所述的抗原肽。
[0053] 在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞為果蠅S2細(xì)胞。
[0054] 在另一優(yōu)選例中，在步驟（a)之前，所述方法還包括以下步驟：
[0055] (1)提供一編碼HCVE2蛋白的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列如SEQID NO. : 6-9 所示；
[0056] (2)制備含有步驟⑴中所述多核苷酸序列的載體；
[0057] (3)將步驟（2)中的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，從而制得權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞。
[0058] 在另一優(yōu)選例中，所述載體為誘導(dǎo)型表達(dá)載體。
[0059] 在另一優(yōu)選例中，所述載體為pcDNA3. 1 (+)質(zhì)粒。
[0060] 在另一優(yōu)選例中，在所述步驟（a)中，當(dāng)所述宿主細(xì)胞中導(dǎo)入的載體為誘導(dǎo)型表 達(dá)載體時，在細(xì)胞密度彡IXl〇7/ml后再添加誘導(dǎo)劑。
[0061] 本發(fā)明的第十一方面，提供了一種治療方法，給需要的對象施用本發(fā)明第一方面 所述的抗原肽、本發(fā)明第二方面所述的融合蛋白、本發(fā)明第三方面所述的多核苷酸、本發(fā)明 第四方面所述的表達(dá)載體或者本發(fā)明第五方面所述的宿主細(xì)胞、本發(fā)明第六方面所述的的 藥物組合物或本發(fā)明第七方面所述的疫苗組合物。
[0062] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[0063] 圖1顯示了sE2蛋白在S2細(xì)胞上清中的表達(dá)、鑒定與純化。（A)S2細(xì)胞sE2表達(dá) 質(zhì)粒pMT-Bip/SE2/His示意圖。（B)sE2原始編碼基因（WT)與密碼子優(yōu)化后的編碼基因 (0ΡΤΙ)克隆到上述載體上后，用磷酸鈣法瞬時轉(zhuǎn)染S2細(xì)胞。優(yōu)化過的序列能夠更加高效地 表達(dá)sE2。（C)氯化鉻誘導(dǎo)后分別于第0, 3, 5, 7, 9天收取細(xì)胞上清，Westernblot檢測sE2 蛋白的表達(dá)情況，一抗為1:1000稀釋的鼠抗His單抗（abmart)，二抗為1:4000稀釋的HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG。（D)SDS-PAGE膠考馬斯亮藍(lán)染色分析鎳柱純化后的sE2蛋白，大小約 46kDa。
[0064] 圖2顯示了sE2蛋白的特性分析。⑷未經(jīng)PNGase處理和經(jīng)過PNGase酶切的sE2 蛋白在SDS-PAGE膠電泳后Westernblot檢測，分別用1:1000稀釋的鼠His單抗（abmart) 和1:1000稀釋的鼠E2單抗（AP33)作為一抗，1:4000稀釋的AP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG作為 二抗。（B)分別用識別構(gòu)象表位的單抗E2C1和識別線性表位的單抗AP33對sE2進(jìn)行ELISA 檢測，以檢驗其抗原性。a-Core單抗為陰性對照。（C)sE2與野生型CH0細(xì)胞的結(jié)合情況。 (D)sE2與穩(wěn)定表達(dá)HCV受體的細(xì)胞系CH0-⑶81的結(jié)合情況，約76. 2%的細(xì)胞能與sE2結(jié) 合。（E)sE2與穩(wěn)定表達(dá)HCV受體的細(xì)胞系CH0-SRB1的結(jié)合情況，約64. 5%的細(xì)胞能與sE2 結(jié)合。（F)sE2可競爭性抑制HCV感染Huh7. 5. 1細(xì)胞。將不同濃度的sE2或BSA與Huh7. 5. 1 細(xì)胞37°C孵育1小時，而后加入HCVConl/JFH-1病毒進(jìn)行感染，72h后進(jìn)行HCVNS3蛋白 的免疫熒光染色，在熒光顯微鏡（Leica)下對每孔的熒光斑點(diǎn)數(shù)進(jìn)行計數(shù)。以O(shè)yg/mL的 熒光斑點(diǎn)數(shù)為空白對照組，感染抑制效果（％) =(空白對照組的熒光斑點(diǎn)數(shù)-相應(yīng)孔中的 熒光斑點(diǎn)數(shù)）/空白對照組的熒光斑點(diǎn)數(shù)*100%。
[0065] 圖3顯示了sE2可特異性檢測HCV感染病人血漿。sE2包被的ELISA板，分別用 1:2000或1:20000稀釋的健康人血漿和丙肝病人血漿進(jìn)行孵育，隨后孵育二抗、顯色，中止 顯色后讀取0D450。在1:20000稀釋時的病人血清也能顯示將近1. 0的讀值。
[0066] 圖4顯示了sE2蛋白可在BALB/c小鼠誘導(dǎo)良好的體液免疫反應(yīng)。⑷免疫實驗 分組。sE2分別以鋁佐劑（Alum)、鋁佐劑+CpG、或弗氏佐劑（FA)為佐劑，并設(shè)PBS對照組。 (B)分別于第0, 2, 4周腹腔注射免疫BALB/c小鼠，分別于第0, 4, 6, 13, 17, 22, 25周取血， 用ELISA的方法檢測血清中針對sE2特異性抗體的終端滴度。為檢測免疫記憶，于第25周 進(jìn)行一次加免，并在第27周取血檢測血清中特異性抗體的終端滴度。三個免疫組小鼠加強(qiáng) 免疫后的抗體終端滴度達(dá)到1〇5_1〇6。
[0067] 圖5顯示了sE2免疫后在兔體內(nèi)誘導(dǎo)出的特異性高抗體的滴度隨時間變化情況。 用弗氏佐劑與sE2混合免疫新西蘭兔，免疫間隔為兩周，每隔2周采血。三免后三周處死， 收集血清。免疫后的抗體終端滴度達(dá)到1〇 6-1〇7。
[0068] 圖6顯示了sE2免疫小鼠血清能夠中和1-7型的HCV病毒。（A)sE2分別以鋁佐 劑、鋁佐劑+CpG、或弗氏佐劑為佐劑，腹腔注射免疫小鼠。小鼠第27周的抗血清1:40稀釋 后進(jìn)行體外中和實驗，確定對所有7個亞型的13株不同HCV病毒的中和效果。（B)每組10 只小鼠的抗血清等體積混合后，對每株病毒中和50%的最高稀釋度。中和效果（％) =(免 疫前血清組的突光斑點(diǎn)數(shù)-相應(yīng)孔