全基因合成野生型HIF-1a(測序結果見SEQIDN0. 1)、 三突變型HIF-1a(命名為HIF-1a3mut，測序結果見SEQIDNO. 2)和七突變型HIF-1a (命名為HIF-1a7mut，測序結果見SEQIDNO. 3)，并構建到puc57載體中。載體分別命名 為puc57-HIF-la、puc57-HIF-la3mut和puc57-HIF-la7mut，并提供對應的質粒和菌 液。
[0021] 吸取puc57-HIF-la菌液2ul加入5mlLB培養(yǎng)基中（含氨芐青霉素1/1000)，放入 37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時。離心收集菌體，提取質粒（詳細步驟參見Takara質粒小 量提取純化試劑盒說明書)。采用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI(購自Takara公司)雙酶切 質粒puc57-HIF_la，酶切體系如下：
37°C水浴30min。瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，回收HIF-la的片段，條帶位置在 2. 2kb(操作步驟參照Takara瓊脂糖核酸純化回收試劑盒說明書)。
[0022] 采用同樣的方法，酶切回收純化基因片段HIF-Ια3mut和HIF-Ια7mut〇
[0023] 采用同樣的方法，酶切回收純化pTRETight四環(huán)素調控載體（購自Clontech公 司）的載體骨架。
[0024] 構建四環(huán)素調控載體介導的HIF-1a野生型及其突變型表達載體。 將HIF-a基因片段插入步驟1得到的酶切回收pTRETight載體中（具體步驟參照Takara公司DNALigationKitVer. 2. 1試劑盒說明書)。連接體系如下：
16°C孵育30min。取連接產(chǎn)物lOul加入lOOulDH5a感受態(tài)細胞(購自Takara公司） 中吹打均勻，冰上靜置20min，再放入42°C水浴90s，迅速置于冰中，靜置3min，加入500ul LB液體培養(yǎng)基，180rpm、37°C振蕩培養(yǎng)lh，取菌液lOOul均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基(含 1/1000AMP)，37°C培養(yǎng)過夜。挑取單克隆菌落于5mlLB培養(yǎng)基(含1/1000氨芐青霉素)中， 180rpm、37Γ培養(yǎng) 12h。
[0025] 用1. 5mL離心管收集l_5mL菌液。12000rpm離心lmin，棄上清；加入250μL溶液 I/RNaseA混合液，漩渦劇烈振蕩直至菌體完全重新懸浮，室溫靜置l-2min;加入250μL 溶液II，輕柔地反復顛倒混勻5-6次，室溫放置l-2min，使菌體充分裂解，直至形成澄清的 裂解溶液；加入350μL溶液III，立即輕柔地反復顛倒混勻5-6次，此時會出現(xiàn)白色絮狀沉 淀；12000rpm室溫離心10min，收集上清；將上清置于DNA純化柱中，靜置l-2min;12000rpm 離心lmin，棄上清，加入500μL溶液PB，12000rpm離心lmin，棄上清，加入500μL溶液W， 12000rpm離心lmin，棄上清。加入 500μL溶液W，12000rpm離心lmin，棄上清，12000rpm 離心3min，以徹底去除純化柱中殘留的液體；將DNA純化柱置于新的離心管中，向純化柱中 央處懸空滴加50-100μL溶液Eluent，室溫放置2min，12000rpm離心lmin，管底即為高純 度質粒DNA。
[0026] 取樣送至上海生物工程有限公司測序驗證確認正確。將構建的質粒命名為pTRE Tight-HIF-1α。同理，構建pTRETight-HIF-1a3mut和pTRETight-HIF-1a7mut質粒 載體。
[0027] 無內(nèi)毒素質粒DNA的制備。
[0028] A、分別取步驟 2 獲得的pTRETight-HIF-1a、pTRETight-HIF-1a3mut和pTRE Tight-HIF-1a7mut重組質粒1μL加入100μLDH5α感受態(tài)細胞中吹勻，放置冰中靜置 20min，再放入42°C水浴90s，迅速置于冰浴中3min，加入500μLLB液體培養(yǎng)基，放置搖床 180rpm37°Clh，取菌液100μL均勻涂布于Amp濃度為100μg/mL的LB固體培養(yǎng)基37°C 培養(yǎng)過夜； B、 取單菌落于3mLAmp濃度為100μg/mL的LB液體培養(yǎng)基中，250rpm、37°C振蕩培養(yǎng) 8小時；從中取300μL菌液接種于300mLAmp濃度為100μg/mL的LB液體培養(yǎng)基中，并 于250rpm、37°C振蕩培養(yǎng)12~16小時； C、 收集菌液，然后在4 °C、4000rpm條件下離心15min，棄上清，收集菌體，然后按照 QIAGENEndoFreePlasmidMaxiKit試劑盒說明書操作步驟提取質粒，得無內(nèi)毒素的pTRE Tight-HIF-1α、pTRETight-HIF-1a3mut和pTRETight-HIF-1a7mut質粒。
[0029] 細胞株HEK293Tet_0ff?Advanced的復蘇與培養(yǎng)。
[0030] 取液氮凍存的HEK293Tet-Off?Advanced細胞株(購自Clontech公司），迅速放 于37°C水浴中解凍，期間不斷晃動使離心管內(nèi)溶液盡量受熱均勻；解凍后迅速加入7mL體 積分數(shù)為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中（DMEM培養(yǎng)液需要提前預熱至37°C)，槍頭輕輕吹 打至無細胞團存在，然后在1300rpm條件下離心6min，棄去上清；再向離心管中加2mL提 前預熱至37°C體積分數(shù)為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，吹打細胞使其懸浮，按照5X104個 細胞將細胞接種于培養(yǎng)皿，并于37°C、含5%的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，然后換液，以后每隔2 天換液至細胞密度達90%時傳代。
[0031] 脂質體轉染。
[0032] 轉染前一天，按照每瓶4X105個HEK293細胞接種到培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24h后細胞 約有70%融合，轉染前4h，用無雙抗PBS清洗2次細胞，將含血清的培養(yǎng)液換為無雙抗、無 血清的優(yōu)化培養(yǎng)液OptiHVIEMI(2mL/瓶）;Lipofectamine?2000 (購自Invitrogen公司） 作為轉染試劑將pTRETight-HIF-la轉染至HEK293Tet-Off?Advanced，具體步驟依照 說明書進行，轉染體系如下：
按照與上述相同的方法分別轉染pTRETight-HIF-1a3mut質粒和pTRE Tight-HIF-Ια7mut質粒。
[0033] 檢測HIF-la蛋白含量。
[0034] 轉染48小時后，更換含有四環(huán)素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。分別培養(yǎng)lmin，3min、5 min、7min、9min、11min、13min、15min、17min、19min、21min、23min、25min、27min、 29min、31min、33min、35min、37min、39min、41min、43min、45min、47min(共 24 個時 間點）后，吸出培養(yǎng)液，將PBS加入培養(yǎng)瓶中洗滌，吸出PBS，加入4%多聚甲醛，室溫下靜置 1〇11^11，固定細胞。胰酶消化細胞，用？83(?!17.2-7.4)稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬 /ml左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成分，2000-3000rpm離心20min。仔 細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心； 應用人HIF-1aELISA試劑盒(購自上海酶聯(lián)生物)檢測細胞培養(yǎng)上清液中的HIF-1α含量，具體操作步驟參照試劑盒說明書； 實驗重復三次，實驗結果見附圖1。由附圖1可看出，本發(fā)明公開的HIF-Ια7mut在細 胞中的存留時間在47min以上，其降解速率明顯低于HIF-a和HIF-1a3mut的降解速率。
[0035] 實施例2重組腺相關病毒的包裝。
[0036] 構建腺相關病毒介導的HIF-la野生型及其突變型載體。
[0037] 采用實施例1步驟1同樣的方法，酶切回收純化pAAV-MCS腺相關病毒載體（購自 Stratagene公司）的載體骨架。將HIF-a、HIF-1a3mut、HIF-1a7mut基因片段分別 連接到酶切回收pAAV-MCS載體中（具體步驟參見實施例1步驟2)，命名為pAAV-HIF-1a、 pAAV-HIF-la3mut和pAAV-HIF-la7mut質粒載體； AAV病毒包裝。
[0038] 參見實施例1步驟5的方法將pAAV-HIF-la、pAAV-HIF-la3mut和 pAAV-HIF-la7mut質粒分別轉染至AAV- 293細胞(購自ATCC)。轉染體系為：
AAV病毒收毒。
[0039] 病毒顆粒同時存在于包裝細胞和培養(yǎng)上清中。可以將細胞和培養(yǎng)上清都收集