抗pd-1抗體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明提供了一種新的ro-i抗體或其功能性片段。特別地，本發(fā)明還涉及所述抗 體在制備用于治療腫瘤的藥物中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] T細(xì)胞共受體信號是緊密調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的重要機(jī)制。共信號的細(xì)胞表面分子（包 括共刺激和共抑制）可分成兩類主要的家族：免疫球蛋白（Ig)超家族與腫瘤壞死因子 (TNF)-腫瘤壞死因子受體（TNFR)超家族。通常T細(xì)胞的激活依賴于HLA-I類或II類分子 呈遞抗原肽。共受體信號則增加或防止這種激活。例如利用激動劑活化CD28或4-1BB，通過 獨特的共刺激途徑，可以提高周圍淋巴器官中淋巴細(xì)胞的啟動和成熟，或增強(qiáng)其在機(jī)體的 應(yīng)答效應(yīng)。免疫激活也可以通過利用拮抗體阻斷共抑制信號通路實現(xiàn)，如程序性細(xì)胞死亡 蛋白1(PD-1)、B7同系物1(B7-H1，也稱為TOL1)通路、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4(CTLA4)、 B/T淋巴細(xì)胞衰減子（BTLA)等通路。這些共抑制信號通路在調(diào)控免疫耐受中發(fā)揮重要作 用，提供了限制、終止和/或減弱免疫反應(yīng)的負(fù)信號。共刺激受體介導(dǎo)的免疫激活是通過刺 激近膜激酶活化并產(chǎn)生磷酸化級聯(lián)放大，而共抑制受體如CTLA4,PD1和B/T淋巴細(xì)胞衰減 因子（BTLA)則招募磷酸酶扭轉(zhuǎn)免疫活化誘導(dǎo)的磷酸化反應(yīng)。免疫調(diào)節(jié)生物制劑可廣泛地 用于治療免疫相關(guān)疾病，抑制諸如移植排斥、自身免疫疾病或炎癥性疾病等引起的免疫亢 進(jìn)，或刺激癌癥、慢性細(xì)菌、病毒感染等免疫機(jī)能減退的免疫應(yīng)答。不同于主流的單克隆抗 體和重組融合蛋白為基礎(chǔ)的療法-既通過中和或消耗靶抗原或靶標(biāo)陽性細(xì)胞，免疫調(diào)節(jié)生 物制劑主要通過結(jié)合并調(diào)控宿主免疫細(xì)胞表面的信號分子，來調(diào)節(jié)抗原特異性T細(xì)胞受體 (TCR)和B細(xì)胞受體（BCR)的信號，從而控制淋巴細(xì)胞應(yīng)答的方向和強(qiáng)度。
[0003] ro-i基因在T細(xì)胞雜交瘤凋亡時發(fā)生上調(diào)，被命名為程序細(xì)胞死亡蛋白1。 PD-1 (⑶279)表達(dá)于活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞，以及活化的骨髓細(xì)胞（IshidaY，AgataY， ShibaharaK，HonjoT.EMBOJ. 1992,1 :3887-3895),也表達(dá)在活化的巨噬細(xì)胞、DC和單核 細(xì)胞，但不存在于他們的幼稚細(xì)胞（AgataY，etal.Int.Immunol. 1996,8 :765-772;Said EA，etal.NatureMed. 2010,16 :452-459)。這些細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)上調(diào)可抑制機(jī)體獲 得性免疫和先天免疫反應(yīng)。ro-i胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域包含兩個釀氨酸位點，一個為免疫受體釀氨酸 抑制性受體（Ι??Μ)，另一個為免疫受體酪氨酸的開關(guān)結(jié)構(gòu)單元（ITSM)。ITSM上酪氨酸的磷 酸化招募酪氨酸磷酸酶SHP2和/或SHP1。這些磷酸酶可對ZAP70、⑶3和PKC去磷酸化，從 而削弱τ細(xì)胞的信號。ro-i主要通過G0/G1期阻滯抑制T細(xì)胞和B細(xì)胞增殖細(xì)胞，并抑制 T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子。ro-i表達(dá)缺失的動物產(chǎn)生各種自身免疫表型，包括自身免疫性心肌 病和狼瘡樣綜合征關(guān)節(jié)炎和腎炎（Nishimuraetal·Immunity. 1999，H:141-51;Nishimura etal.Science. 2001,291 :319-22)。此外，ro-1也在自身免疫性腦脊髓炎、全身性紅斑狼 瘡、移植物抗宿主病（GVHD)、I型糖尿病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等中發(fā)揮作用（Salamaetal.J ExpMed. 2003,198 :71-78;ProkuninaandAlarcon-Riquelme，HumMolGenet. 1992,13 : R143;Nielsenetal·Lupus. 2004,11 :510)〇
[0004] 目前報道PD-1 配體有兩個，PD-L1/B7H1/CD274 和PD-L2/B7-DC/CD273(Freeman GJ,etal.J.Exp.Med. 2000,192 ： 1027-1034；LatchmanY,etal.NatureImmunol. 2001,2 ： 261-268)。PD-L1在免疫細(xì)胞如B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞上低水平表達(dá)，并在 細(xì)胞活化時表達(dá)上調(diào)。PD-L1也表達(dá)于如血管內(nèi)皮細(xì)胞、心臟、肺、胰臟、肌肉、角質(zhì)形成細(xì) 胞和胎盤等非淋巴器官。PD-L1在非淋巴樣組織中的表達(dá)揭示，PD-L1可能調(diào)節(jié)自身反應(yīng)性 T細(xì)胞、B細(xì)胞以及外周組織中骨髓細(xì)胞的功能，也可能參與靶器官的炎癥反應(yīng)。PD-L1的 表達(dá)主要是通過1型和2型干擾素調(diào)節(jié)，這也是血管內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞ro-Li水平的主 要調(diào)節(jié)劑。PD-L1也表達(dá)于腫瘤細(xì)胞中，并與預(yù)后不良密切相關(guān)。各種病毒感染可誘導(dǎo)宿 主組織大量表達(dá)H)-L1。盡管TO-L2轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在非造血組織如心臟、肝臟和胰臟被發(fā)現(xiàn)，但 ro-L2/B7-DC在細(xì)胞表面的表達(dá)僅限于巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，并取決于IFNY和Th2細(xì)胞 因子的產(chǎn)生。PD-L1和TO-L2的表達(dá)也受到不同刺激的影響。巨噬細(xì)胞上的H)-L1由INFY 誘導(dǎo)，而TO-L2則受IL-4調(diào)控。類似現(xiàn)象也出現(xiàn)在樹突狀細(xì)胞上。研究揭示ro-Li可能優(yōu) 先調(diào)節(jié)Thl應(yīng)答，而ro-L2則調(diào)節(jié)Th2細(xì)胞應(yīng)答。PD-L1和ro-L2都可抑制T細(xì)胞的增殖、 細(xì)胞因子的產(chǎn)生以及β?/β2整合素介導(dǎo)的粘附作用。PD-L2也可觸發(fā)樹突狀細(xì)胞反向信 號、導(dǎo)致IL-12產(chǎn)生和Τ細(xì)胞活化。
[0005] PD-L1-PD-1調(diào)節(jié)軸在人體Τ細(xì)胞活化控制與機(jī)體免疫耐受維持中發(fā)揮關(guān)鍵作用， 也被腫瘤細(xì)胞以及病毒在慢性病毒感染所利用（YaoS，ChenL.TrendsMol.Med. 2006,12: 244-246;ZouW，ChenL.NatureRev.Immunol. 2008,8 :467-477)。PD-L1 在多種人體癌癥 組織中高度表達(dá)（Dongetal，Nat.Med2002,8:787-9)。PD-L1的表達(dá)與某些類型惡性腫 瘤的進(jìn)展和預(yù)后不良具有相關(guān)性（ThompsonRH，etal·CancerRes. 2006,66:3381-3385)。 PD-L1-PD1通路也已被證實促進(jìn)T細(xì)胞耗竭（ZajacAJ，etal…J.Exp.MecL1998，188: 2205-2213)。腫瘤或病毒引起的H)-L1-PD1通路可通過多種機(jī)制來實現(xiàn)宿主免疫監(jiān)視的逃 逸，包括促進(jìn)T細(xì)胞失活、疲勞、反應(yīng)遲鈍和細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)Treg細(xì)胞擴(kuò)增，以及增強(qiáng)腫瘤內(nèi) 在性抵抗殺傷和凋亡的能力。通過癌細(xì)胞介導(dǎo)的ro-ι與ro-Li相互作用導(dǎo)致腫瘤浸潤淋 巴細(xì)胞減少，T細(xì)胞受體介導(dǎo)的T細(xì)胞增殖受到抑制，并增加免疫逃逸（Dongetal.J.Mol. Med.2003,81 :281-7；Blanketal.CancerImmunol.Immunother. 2005,54 :307-314 ; Konishietal·Clin.CancerRes. 2004,10:5094-100)。
[0006] 迄今為止，還沒有令人滿意的方法可誘導(dǎo)針對癌癥患者有效的免疫應(yīng)答，特異性 阻斷ro-Ll-PD-Ι調(diào)節(jié)軸，提供了在激活抗腫瘤及抗病毒免疫應(yīng)答的方法，因此，急需開發(fā) 設(shè)計特異性阻斷ro-Ll-PD-Ι調(diào)節(jié)軸的治療方法，來克服癌癥患者或慢性感染的免疫抑制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] -般地，本發(fā)明提供了一種新的ro-i抗體或其功能性片段。特別地，本發(fā)明的抗 體是人源化抗體。
[0008] 在一個方面，本發(fā)明提供了能夠特異性結(jié)合ro-i的抗體或其功能性片段，其中所 述抗體包含重鏈和輕鏈，其中（i)所述重鏈包含分別具有如SEQIDN0 :7、8和11或者9、 10和11所示的氨基酸序列的H-⑶R1、H-⑶R2和H-⑶R3 ;和（ii)所述輕鏈包含分別具有如 SEQIDN0 :12、13 和 14 所示的氨基酸序列的L-CDR1、L-CDR2 和L-CDR3。
[0009] 在一個方面，本發(fā)明提供了能夠特異性結(jié)合ro-i的抗體或其功能性片段，其中 (i)所述重鏈包含具有如SEQIDNO:1、2、4或5所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；并且（ii) 所述輕鏈包含具有如SEQIDNO:3或6所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
[0010] 在另一個方面，本發(fā)明提供了能夠特異性結(jié)合ro-i的抗體或其功能性片段，其中 (i)所述重鏈包含具有如SEQIDN0 :4或5所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；并且（ii)所述 輕鏈包含具有如SEQIDN0 :6所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
[0011] 優(yōu)選地，本發(fā)明的抗PD-1抗體選自10F8、15H6、BA08-1和BA08-2。
[0012] 在又一個方面，本發(fā)明提供了分離的多核苷酸，其編碼本發(fā)明的抗ro-i抗體或其 功能性片段。
[0013] 在又一個方面，本發(fā)明提供了分離的多核苷酸的組合，其包括：編碼本發(fā)明抗 ro-i抗體或其功能性片段之輕鏈的多核苷酸和編碼本發(fā)明抗ro-i抗體或其功能性片段之 重鏈的多核苷酸。
[0014] 在又一個方面，本發(fā)明提供了表達(dá)載體，其包含本發(fā)明的多核苷酸或者本發(fā)明的 多核苷酸的組合，所述多核苷酸與允許其所編碼的多肽在宿主細(xì)胞或無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表 達(dá)的調(diào)節(jié)序列有效連接。優(yōu)選地，所述表達(dá)載體是病毒載體或非病毒載體。
[0015] 在又一個方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含本發(fā)明的抗ro-i抗體或其功能 性片段，以及可藥用載體。
[0016] 在又一個方面，本發(fā)明提供了用于在有需要的對象中治療或預(yù)防癌癥或感染性疾 病的方法，其包括將本發(fā)明的抗ro-ι抗體或其功能性片段、多核苷酸、多核苷酸組合、表達(dá) 載體和/或藥物組合物施用給所述對象。在一些特定實施方案中，所述對象已接受或待接 受抗⑶3抗體治療。
[0017] 在又一個方面，本發(fā)明提供了用于在有需要的對象中增強(qiáng)T細(xì)胞免疫應(yīng)答的方 法，其包括將本發(fā)明的抗ro-i抗體或其功能性片段、多核苷酸、多核苷酸組合、表達(dá)載體和 /或藥物組合物施用給所述對象。在一些實施方案中，所述增強(qiáng)τ細(xì)胞免疫應(yīng)答包括增強(qiáng)τ 細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生，優(yōu)選地所述細(xì)胞因子包括IL-2和/或IFN-γ。在一些優(yōu)選的實施方 案中，所述增強(qiáng)T細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生包括抗CD3抗體刺激的T細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生。在 另一些優(yōu)選的實施方案中，所述對象是癌癥患者，例如H)-L1陽性癌癥患者，優(yōu)選地肺癌和 黑素瘤患者。
[0018] 在又一個方面，本發(fā)明提供了用于在有需要的對象中促進(jìn)T細(xì)胞活化的方法，其 包括將本發(fā)明的抗ro-i抗體或其功能性片段、多核苷酸、多核苷酸組合、表達(dá)載體和/或藥 物組合物施用給所述對象。優(yōu)選地，所述方法還包括將抗CD3抗體施用給所述對象。
[0019] 在又一個方面，本發(fā)明提供了用于在有需要的對象中消除ro-Li對τ細(xì)胞活化之 抑制的方法，其包括將本發(fā)明的抗ro-i抗體或其功能性片段、多核苷酸、多核苷酸組合、表 達(dá)載體和/或藥物組合物施用給所述對象。優(yōu)選地，所述方法還包括將抗CD3抗體施用給 所述對象。
[0020] 在又一個方面