一種安水金線鲃脾臟細(xì)胞系的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種利用安水金線鮑脾臟組織建立細(xì)胞系的方法，屬于淡水水生生物 細(xì)胞培養(yǎng)和超低溫冷凍保存的技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 安水金線鮑Sinocyclocheilus anshuiensis (Regan, 1904)隸屬于經(jīng)形目 (切priniformes)經(jīng)科（切prinidae)金線鮑屬（Sinocyclocheilus)，是2013年發(fā)表的一 盲魚新種，目前，本種已知的分布點僅為廣西壯族自治區(qū)凌云縣邏樓鎮(zhèn)安水村一桐穴，對它 的研究也僅見于其分類特征的描述和分類地位的確認(rèn)。
[0003]因安水金線鮑種群數(shù)量較小，且不易獲得，因此，如何保護(hù)和保存運一珍稀桐穴魚 類的種質(zhì)資源成為現(xiàn)今亟待解決的問題。塘養(yǎng)環(huán)境下，安水金線鮑還不能實現(xiàn)性腺的正常 發(fā)育成熟，實現(xiàn)更進(jìn)一步的人工繁殖還存在一定困難，因此，通過保存其精子、卵子、胚胎、 個體等來保存其種質(zhì)資源的方法已不可行，所W發(fā)明人將目光投向了安水金線鮑的體細(xì)胞 培養(yǎng)。
[0004] 魚類細(xì)胞培養(yǎng)起于20世紀(jì)60年代，發(fā)展至今已建立了280余株細(xì)胞系，中國的魚 類細(xì)胞培養(yǎng)歷經(jīng)30多年，只建立了50余株細(xì)胞系，建立細(xì)胞系的物種不足中國魚類總數(shù)的 1. 5%(中國魚類超過3500種），由此可見，細(xì)胞系的構(gòu)建速度是非常緩慢的，關(guān)注度不夠、 參與的工作者較少可能是其原因之一；其次，相較于哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)，魚類細(xì)胞培養(yǎng)中更 易發(fā)生污染，導(dǎo)致失敗率上升，而現(xiàn)有的專利或文章中大多將運一現(xiàn)象歸結(jié)為技術(shù)不過關(guān)， 而嫌少注重魚體本身的質(zhì)量問題，在安水金線鮑細(xì)胞培養(yǎng)實踐中，魚體的生活狀態(tài)也直接 影響了細(xì)胞系構(gòu)建的成??；另外，因安水金線鮑野外生境的局限性，對其生活習(xí)性的了解較 少，運也在一定程度上加大了安水金線鮑細(xì)胞培養(yǎng)的難度。因此，安水金線鮑脾臟細(xì)胞系的 成功構(gòu)建是建立在長期對安水金線鮑野生和塘養(yǎng)生態(tài)習(xí)性了解的基礎(chǔ)上，同時，安水金線 鮑是中國首個實現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)的盲魚，此細(xì)胞系也是中國首個盲魚的細(xì)胞系。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，未 見與本發(fā)明的相同報道。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽0化]本發(fā)明的目的是提供一種操作簡便易行的安水金線鮑脾臟細(xì)胞系的構(gòu)建方法，W滿足對安水金線鮑快速核型分析、種質(zhì)資源保存和桐穴適應(yīng)性研究的需要。
[0006] 具體地，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種安水金線鮑脾臟細(xì)胞系的構(gòu)建方法， 該構(gòu)建方法包括如下步驟：1)安水金線鮑脾臟的獲取：先用80-120ppm的MS-222麻醉安水 金線鮑；W75 %酒精消毒魚體后，取其脾臟，加入皿SS消毒液浸泡脾臟組織；浸泡15-30分 鐘后，將脾臟組織用皿SS消毒液清洗3-5次；2)原代培養(yǎng)：將通過1)獲得的脾臟組織剪成 約100mm3的組織小塊，并將其接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在18-24Γ培養(yǎng)箱中倒置過夜，次日再 加入原代培養(yǎng)液，在18-24Γ培養(yǎng)箱中啟動原代培養(yǎng)，每Ξ天半量更換所述原代培養(yǎng)液，第 6-9天細(xì)胞開始從組織塊中遷移，20-40天長成細(xì)胞單層；3)傳代培養(yǎng)：原代脾臟細(xì)胞鋪滿 瓶底80%后開始傳代，先吸出培養(yǎng)瓶中的原代培養(yǎng)液，W含0. 1-0. 2%的膜蛋白酶的膜酶 消化法懸起細(xì)胞，細(xì)胞變圓后，加入傳代培養(yǎng)液l-2mlW中和膜酶反應(yīng)，首次傳代按1:1傳， 此后按1:2進(jìn)行傳代，于18-24Γ培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；每4-6天傳代一次，傳至第8代時，細(xì) 胞培養(yǎng)液換成基礎(chǔ)培養(yǎng)液，所述安水金線鮑脾臟細(xì)胞系建立成功。
[0007] 進(jìn)一步地，所述皿SS消毒液為含有濃度為100-300IU/ml的青霉素、濃度為 100-300μg/ml的鏈霉素、濃度為20-40μg/ml的慶大霉素W及濃度為20-40μg/ml的兩性 霉素B的Hanks平衡鹽溶液。
[0008] 進(jìn)一步地，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液為含有占總體積的10-15%的胎牛血清和濃度為 300-400mg^的谷氨酷胺的kl5培養(yǎng)液。
[0009] 進(jìn)一步地，所述原代培養(yǎng)液為含有占總體積的15-25 %的胎牛血清、濃度為 600-800mg^的谷氨酷胺、濃度為100-200IU/ml的青霉素、濃度為100-300μg/ml的鏈霉 素、濃度為20-40μg/ml的慶大霉素W及濃度為20-40μg/ml的兩性霉素B的心15培養(yǎng)液。
[0010] 進(jìn)一步地，所述傳代培養(yǎng)液為含有占總體積的10-20 %的胎牛血清、濃度為 500-600mg^的谷氨酷胺、濃度為20-40μg/ml的慶大霉素W及濃度為20-40μg/ml的兩性 霉素B的kl5培養(yǎng)液。
[0011] 進(jìn)一步地，所述原代培養(yǎng)液、所述傳代培養(yǎng)液和所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液的抑值為 7. 2-7. 4,滲透壓為 280-360m0sm/l。
[0012] 進(jìn)一步地，所述構(gòu)建方法還包括如下細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的步驟：1)配制細(xì)胞凍存 液：凍存液包括kl5培養(yǎng)液、胎牛血清和DMS0,按4. 5 :4. 5 :1的體積比混合，現(xiàn)用現(xiàn)配；2) 細(xì)胞凍存：取對數(shù)生長期的細(xì)胞，經(jīng)上述膜酶消化后，細(xì)胞懸液800-1200巧m離屯、6-10分 鐘，棄掉上清液；向細(xì)胞沉淀中加入配制的細(xì)胞凍存液，重懸，使細(xì)胞的濃度約為IX106個 /ml，將1ml細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至1. 8ml凍存管中，將凍存管置于程序降溫盒中，-80°C放置24-48 小時，然后放入液氮中長期保存；3)細(xì)胞復(fù)蘇：將上述凍存管從液氮中取出，放入37°C水浴 鍋中快速搖晃至融化；然后在無菌操作臺中，將解凍細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15ml離屯、管中，并加入等 量基礎(chǔ)培養(yǎng)液，800-100化pm離屯、6-8分鐘，除上清液；用基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至細(xì) 胞培養(yǎng)瓶中，18-24Γ培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5-9天細(xì)胞即長成單層。
[0013] 本發(fā)明的各步驟中所用的百分比為體積百分比。
[0014] 本發(fā)明的顯著效果在于： 陽015] 1.本發(fā)明的構(gòu)建方法操作簡便易行，并且構(gòu)建方法重復(fù)性強，構(gòu)建的細(xì)胞系穩(wěn)定 性好。
[0016] 2.相對于用于核型分析的血液短期培養(yǎng)，采用本發(fā)明的構(gòu)建方法獲得的脾臟組織 塊中剛遷移出來的細(xì)胞具有活性，且細(xì)胞量大，可用于染色體分析。
[0017] 3.與罐條細(xì)胞系相比，用本發(fā)明的構(gòu)建方法獲得的脾臟細(xì)胞系原代培養(yǎng)中組織塊 污染率較低，從而提高了成功率。
[0018] 4.本發(fā)明構(gòu)建的安水金線鮑脾臟細(xì)胞系形態(tài)為成纖維樣，能夠連續(xù)傳代并直接應(yīng) 用于生物學(xué)特性研究，滿足了對安水金線鮑種質(zhì)資源保存和理論研究及應(yīng)用的需要。
[0019] 5.細(xì)胞培養(yǎng)不是獨立事件，其需要結(jié)合魚本身的生物學(xué)特點，用本發(fā)明的構(gòu)建方 法獲得的安水金線鮑脾臟細(xì)胞是中國首個盲魚的細(xì)胞系，為研究桐穴魚類對桐穴環(huán)境的適 應(yīng)性提供了很好的素材，奠定了桐穴適應(yīng)性研究的基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0020] 圖1是示出不同消毒方式對安水金線鮑脾臟組織塊細(xì)胞遷移的影響的圖。
[0021] 圖2是示出不同培養(yǎng)液對安水金線鮑脾臟細(xì)胞生長的影響的圖。
【具體實施方式】
[0022] 從下文的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的上述方面和本發(fā)明的其他方面將是明顯的。 陽〇2引 實施例1
[0024] 1.制備皿SS消毒液和細(xì)胞培養(yǎng)液 陽0巧]皿SS消毒液：向皿SS中加入抗生素，使青霉素的濃度為200IU/ml，鏈霉素濃度為 200μg/ml，慶大霉素的濃度為30μg/ml，兩性霉素B濃度為30μg/ml。
[00%] 基礎(chǔ)培養(yǎng)液：向kl5培養(yǎng)液中加入谷氨酷胺和胎牛血清，使谷氨酷胺的濃度為 360mg/l，胎牛血清占總體積的15%。
[0027] 原代培養(yǎng)液：向kl5培養(yǎng)液中加入谷氨酷胺、胎牛血清和抗生素，使谷氨酷胺 的濃度為700mg/l，胎牛血清占總體積的20 %，青霉素的濃度為150IU/ml，鏈霉素濃度為 150μg/ml，慶大霉素的濃度為30μg/ml，兩性霉素B濃度為30μg/ml。
[0028] 傳代培養(yǎng)液：向kl5培養(yǎng)液中加入谷氨酷胺、胎牛血清和抗生素，使谷氨酷胺的 濃度為600mg/l，胎牛血清占總體積的20%，慶大霉素的濃度為20μg/ml，兩性霉素B濃度 為 20μg/