從LNG中取出,在真空狀態(tài)下投入冰浴中,按照平均560°C /min的升溫速率迅速降溫至3.8°C ;
步驟三:將凍存液倒入0.9%的鹽水中,維持溫度在3.80C的條件下,在次聲波振蕩條件下加入17%的不含纖維蛋白原的人血清白蛋白,3%的γ-球蛋白,0.5%的二羥基丙酮,0.7%的L-甘油醛,0.23%的細胞生長因子,0.8%的非必需氨基酸,0.12%的R-谷氨酰胺,0.03%的β -巰基乙醇,0.69%的NaCl和75.63%的去離子水,細胞生長因子為表皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子和血管內皮生長因子1:1:1:1的混合溶液,表皮生長因子的濃度為75Pg/L,酸性成纖維細胞生長因子的濃度為2(^g/L,堿性成纖維細胞生長因子的濃度為2(^g/L,血管內皮生長因子的濃度為6Pg/L,調節(jié)體系的pH為7.6,加入1.5%的羥乙基哌嗪乙硫磺酸,繼續(xù)在次聲波條件下振蕩42s ;
步驟四:將稀釋后的凍存液在400r/min的條件下離心5min,去除上清液,向細胞沉淀中加入0.23%的細胞生長因子,重新懸浮細胞。
[0052]實驗凍存材料:按照美國臍帶血庫標準操作規(guī)程無菌采集健康、足月分娩產婦的臍帶血,采集后24h內處理。
[0053]實驗方法:
步驟一:抽取骨髓,提純分離出單個核細胞,將原代細胞接種培養(yǎng)48h后,在含有8mmol/L的地塞米松,2.16g/L的β -磷酸甘油鈉和37.5mg/L的2-磷酸抗壞血酸的培養(yǎng)液中,5%C02的培養(yǎng)箱中,37°C的溫度下培養(yǎng)8d ;用0.25%的胰蛋白酶-0.02%的EDTA培養(yǎng)液進行第I次傳代;以1.3 X 1Vcm2的細胞密度接種,培養(yǎng)至P2代。
[0054]步驟二:將P2代臍帶血團完全浸泡在0.85%~0.9%的鹽水中,維持溫度在3.2-3.90C的條件下,在次聲波振蕩條件下加入8.2%~8.6%的滲透性保護液,0.8%~1%的單糖,17%的不含纖維蛋白原的人血清白蛋白,3%的γ-球蛋白,2.1%~2.3%的Rho抑制劑,繼續(xù)在次聲波條件下振蕩30~45s,加入玻璃化液;
步驟三:將步驟二中制得的混合液在真空狀態(tài)下,直接投入液氮中,按照平均600°C /min的降溫速率迅速降溫至_196°C ;
步驟四:存入液氮罐中保存24h。
[0055]取出凍存液按前述復蘇方法進行復蘇培養(yǎng)。
[0056]測定細胞的復蘇率:將3 X 15個復蘇凍存干細胞連續(xù)培養(yǎng)6天,用血球計數板計算出培養(yǎng)后的細胞總數,根據公式:復蘇率=培養(yǎng)后細胞總數+ (3X105X增值率),得到凍存細胞的復蘇率;同時將3 X 15個P2代干細胞連續(xù)培養(yǎng)6天,用血球計數板計算出培養(yǎng)后的細胞總數,根據公式:增值率=培養(yǎng)后細胞總數+ (3X 105)。
[0057]實驗結果:測得復蘇率為97.6%
實施例6
一種高復蘇率的凍存臍帶血干細胞復蘇方法,包括以下步驟:
步驟五:將凍存液從液氮中取出,投入LNG中升溫Imin ;
步驟六:將凍存液從LNG中取出,在真空狀態(tài)下投入冰浴中,按照平均560°C /min的升溫速率迅速降溫至3.5°C ;
步驟七:將凍存液倒入0.9%的鹽水中,維持溫度在3.50C的條件下,在次聲波振蕩條件下加入17%的不含纖維蛋白原的人血清白蛋白,3%的γ-球蛋白,0.35%的二羥基丙酮,0.55%的L-甘油醛,0.22%的細胞生長因子,1.1%的非必需氨基酸,0.09%的R-谷氨酰胺,0.036%的β -巰基乙醇,0.68%的NaCl和74.474%的去離子水,細胞生長因子為表皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子和血管內皮生長因子1:1:1:1的混合溶液,表皮生長因子的濃度為63Pg/L,酸性成纖維細胞生長因子的濃度為17Pg/L,堿性成纖維細胞生長因子的濃度為19Pg/L,血管內皮生長因子的濃度為5Pg/L,調節(jié)體系的pH為7.8,加入1.5%的羥乙基哌嗪乙硫磺酸,繼續(xù)在次聲波條件下振蕩45s ;
步驟八:將稀釋后的凍存液在400r/min的條件下離心5min,去除上清液,向細胞沉淀中加入0.21%的細胞生長因子,重新懸浮細胞。
[0058]實驗凍存材料:按照美國臍帶血庫標準操作規(guī)程無菌采集健康、足月分娩產婦的臍帶血,采集后24h內處理。
[0059]實驗方法:
步驟一:抽取骨髓,提純分離出單個核細胞,將原代細胞接種培養(yǎng)48h后,在含有8mmol/L的地塞米松,2.16g/L的β -磷酸甘油鈉和37.5mg/L的2-磷酸抗壞血酸的培養(yǎng)液中,5%C02的培養(yǎng)箱中,37°C的溫度下培養(yǎng)8d ;用0.25%的胰蛋白酶-0.02%的EDTA培養(yǎng)液進行第I次傳代;以1.3 X 1Vcm2的細胞密度接種,培養(yǎng)至P2代。
[0060]步驟二:將P2代臍帶血團完全浸泡在0.85%~0.9%的鹽水中,維持溫度在3.2-3.90C的條件下,在次聲波振蕩條件下加入8.2%~8.6%的滲透性保護液,0.8%~1%的單糖,17%的不含纖維蛋白原的人血清白蛋白,3%的γ-球蛋白,2.1%~2.3%的Rho抑制劑,繼續(xù)在次聲波條件下振蕩30~45s,加入玻璃化液;
步驟三:將步驟二中制得的混合液在真空狀態(tài)下,直接投入液氮中,按照平均600°C /min的降溫速率迅速降溫至_196°C ;
步驟四:存入液氮罐中保存24h。
[0061]取出凍存液按前述復蘇方法進行復蘇培養(yǎng)。
[0062]測定細胞的復蘇率:將3 X 15個復蘇凍存干細胞連續(xù)培養(yǎng)6天,用血球計數板計算出培養(yǎng)后的細胞總數,根據公式:復蘇率=培養(yǎng)后細胞總數+ (3X105X增值率),得到凍存細胞的復蘇率;同時將3 X 15個P2代干細胞連續(xù)培養(yǎng)6天,用血球計數板計算出培養(yǎng)后的細胞總數,根據公式:增值率=培養(yǎng)后細胞總數+ (3X 105)。
[0063]實驗結果:測得復蘇率為97.4%
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已,并不用以限制本發(fā)明,凡在本發(fā)明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等,均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
【主權項】
1.一種高復蘇率的凍存臍帶血干細胞復蘇方法,其特征在于包括以下步驟: 步驟一:將凍存液從液氮中取出,投入LNG中升溫Imin ; 步驟二:將凍存液從LNG中取出,在真空狀態(tài)下投入冰浴中,按照平均560°C /min的升溫速率迅速降溫至3.2-3.9 0C ; 步驟三:將凍存液倒入0.9%的鹽水中,維持溫度在3.2-3.90C的條件下,在次聲波振蕩條件下加入17%的不含纖維蛋白原的人血清白蛋白,3%的γ-球蛋白,0.8%~1%的單糖,0.8%~1.2%的非必需氨基酸,0.08%~0.12%的R-谷氨酰胺,0.03%~0.04%的β -巰基乙醇,調節(jié)體系的pH為7.6-7.9,加入1.5%的羥乙基哌嗪乙硫磺酸,繼續(xù)在次聲波條件下振蕩30?45s ; 步驟四:將稀釋后的凍存液在400r/min的條件下離心5min,去除上清液,向細胞沉淀中加入0.21%~0.23%的細胞生長因子,重新懸浮細胞。2.如權利要求1所述的一種高復蘇率的凍存臍帶血干細胞復蘇方法,其特征在于:所述次聲波的頻率為8~13Hz。3.如權利要求1所述的一種高復蘇率的凍存臍帶血干細胞復蘇方法,其特征在于:所述細胞生長因子為表皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子和血管內皮生長因子。4.如權利要求3所述的一種高復蘇率的凍存臍帶血干細胞復蘇方法,其特征在于:所述表皮生長因子的濃度為50~75Pg/L,所述堿性成纖維細胞生長因子的濃度為15~2(^g/L,所述血管內皮生長因子的濃度為4~6Pg/L。5.如權利要求1所述的一種高復蘇率的凍存臍帶血干細胞復蘇方法,其特征在于:所述單糖為二羥基丙酮和L-甘油醛的混合溶液。6.如權利要求5所述的一種高復蘇率的凍存臍帶血干細胞復蘇方法,其特征在于:所述單糖包括0.3%~0.5%的二羥基丙酮和0.5%~0.7%的L-甘油醛。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高復蘇率的凍存臍帶血干細胞復蘇方法,屬于干細胞復蘇領域。本發(fā)明的一種高復蘇率的凍存臍帶血干細胞復蘇方法,包括將凍存液從液氮中取出,投入LNG中升溫1min;將凍存液從LNG中取出,在真空狀態(tài)下投入冰浴中,按照平均560℃/min的升溫速率迅速降溫至3.2~3.9℃等四個步驟。本發(fā)明的一種高復蘇率的凍存臍帶血干細胞復蘇方法具有對臍帶血干細胞低細胞毒性,在玻璃化凍存復蘇過程中低細胞毒性損傷,低滲透性損傷,提高凍存細胞復蘇率的特點。
【IPC分類】C12N5/0789
【公開號】CN105331582
【申請?zhí)枴緾N201510777831
【發(fā)明人】黃林海
【申請人】黃林海
【公開日】2016年2月17日
【申請日】2015年11月16日