一種無創(chuàng)性獲取胎兒完整基因組dna的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說，是關(guān)于一種無創(chuàng)性獲取胎兒完整基因組DNA的 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 產(chǎn)前診斷是在胎兒出生前，利用各種技術(shù)方法診斷胎兒是否患有遺傳病或先天性 疾病的一種手段，是人類細(xì)胞遺傳學(xué)、分子遺傳學(xué)、生物化學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)實(shí)踐相結(jié)合的一口 學(xué)科。通過產(chǎn)前診斷，對(duì)可能出現(xiàn)遺傳病或與遺傳因素有關(guān)的疾病W及具有其他導(dǎo)致崎胎 因素的高風(fēng)險(xiǎn)胎兒提供充足可靠的信息，科學(xué)指導(dǎo)妊娠期的挾擇或適當(dāng)治療，達(dá)到減少缺 陷兒出生率從而實(shí)現(xiàn)國家優(yōu)生優(yōu)育的目標(biāo)。
[0003] 現(xiàn)有的產(chǎn)前診斷技術(shù)主要包括有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷和無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷兩種類型。有創(chuàng) 性產(chǎn)前診斷主要包括羊膜腔穿刺、絨毛取樣、廝血取樣、胎兒鏡和胚胎活檢等，W羊膜腔穿 刺和絨毛取樣兩種最常用，是目前產(chǎn)前遺傳診斷的主要方法。然而，對(duì)胎兒有創(chuàng)取材時(shí)存在 W下風(fēng)險(xiǎn)；1、胎兒一過性必動(dòng)過緩；2、0. 1 %~0. 9%的被檢者發(fā)生早產(chǎn)或胎兒宮內(nèi)死亡； 3、廝帶取血后廝帶胎盤滲血；4、羊膜腔內(nèi)感染；5、羊膜破裂；6、胎兒崎形。無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷 包括超聲波檢查、母體外周血清標(biāo)志物測定、無創(chuàng)胎兒基因和細(xì)胞遺傳學(xué)分析等。
[0004] 在無創(chuàng)性方法中，超聲波檢查應(yīng)用最為廣譜，但其只能從形態(tài)上分辨一些有明顯 先天崎形的胎兒，對(duì)于形態(tài)正常而帶有其它遺傳缺陷的胎兒則無法鑒別。采用來自母體外 周血液中的胎兒細(xì)胞或者母體血漿、血清中胎兒核酸進(jìn)行無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的新技術(shù)顯然具 有更大的應(yīng)用前途。孕婦血漿及血清中存在胎兒游離DNA及RNA，通過提取母體血液的總 DNA和RNA，可用于唐氏篩查、鑒定男性胎兒、診斷化D血型不合性溶血等。然而由于現(xiàn)有技 術(shù)無法從母體血液總DNA和RNA中分離出完整的胎兒基因信息，絕大多數(shù)的遺傳病都無法 W類似的無創(chuàng)方法進(jìn)行檢測。妊娠期間，由于胎盤界面的胎兒-母體輸血，少數(shù)胎兒細(xì)胞可 通過胎盤屏障進(jìn)入到母體循環(huán)中，主要有Η種細(xì)胞：滋養(yǎng)細(xì)胞、淋己細(xì)胞和胎兒有核紅細(xì)胞 (fetalnuclearredbloodcells,FNRBC)。FNRBC在孕早期存在于胎兒循環(huán)中的數(shù)量最 多，提示其在母體循環(huán)系統(tǒng)中存在數(shù)量也較多；另外FNRBC在孕婦外周血中的壽命十分有 限，任何利用FNRBC進(jìn)行的產(chǎn)前診斷都不可能受到既往妊娠的FNRBC的影響。因此FNRBC 是孕早期從孕婦外周血中分離胎兒細(xì)胞用于產(chǎn)前診斷的最佳細(xì)胞類型。但由于FNRBC在母 體外周血中的數(shù)量極其有限，各種報(bào)道的分離、富集、鑒定胎兒有核紅細(xì)胞的方法，都存在 操作繁瑣，缺乏經(jīng)濟(jì)實(shí)用性的缺陷，無法達(dá)到無創(chuàng)產(chǎn)前遺傳診斷的要求。由于現(xiàn)有技術(shù)都無 法徹底解決產(chǎn)前遺傳診斷的物質(zhì)基礎(chǔ)問題，因此，有必要提供一種精確、簡單、高效的無創(chuàng) 性獲取胎兒完整基因組DNA的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服現(xiàn)有報(bào)道的分離、富集、鑒定胎兒有核細(xì)胞的方法中存在的操作繁瑣、 缺乏經(jīng)濟(jì)實(shí)用性的缺陷，本申請(qǐng)的發(fā)明人結(jié)合個(gè)體遺傳特征鑒定的方法，可直接定位胎兒 有核細(xì)胞，利用激光捕獲顯微切割技術(shù)，切割胎兒細(xì)胞，從而精確獲得胎兒來源的全基因組DNA，為無創(chuàng)性產(chǎn)前遺傳診斷應(yīng)用奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。
[0006] 因此，本發(fā)明的目的在于提供一種精確、簡單、高效的無創(chuàng)性獲取胎兒完整基因組 DNA的方法。
[0007] 本發(fā)明是通過W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0008] -種無創(chuàng)性獲取胎兒完整基因組DNA的方法，包括W下步驟：
[0009]A)從母體（孕婦）外周血中分離有核細(xì)胞；
[0010] B)制備有核細(xì)胞涂片；
[0011] C)對(duì)比分析胎兒特有或父源特有（母源無）遺傳標(biāo)記；
[0012] D)合成胎兒特有或父源特有（母源無）遺傳標(biāo)記探針，標(biāo)記胎兒有核細(xì)胞；
[0013]巧顯微切割分離被標(biāo)記的胎兒有核細(xì)胞；
[0014]巧對(duì)切割所得胎兒有核細(xì)胞單細(xì)胞進(jìn)行高保真全基因組DNA擴(kuò)增。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明，所述母體（孕婦）外周血為妊娠5~38周的母體（孕婦）外周靜脈 血。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明，所述對(duì)比分析胎兒特有或父源特有（母源無）遺傳標(biāo)記包括使用SNP 組合或STR組合的個(gè)體遺傳標(biāo)記分型鑒定。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明，所述合成胎兒特有或父源特有（母源無）遺傳標(biāo)記探針，包括使用 SNP探針、STR探針或其組合。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明，所述合成胎兒特有或父源特有（母源無）遺傳標(biāo)記探針還包括使用 生物素、地高辛、dinitrophenyl、aminoacetylfluorine或其組合進(jìn)行探針標(biāo)記的步驟。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明，所述標(biāo)記胎兒有核細(xì)胞包括應(yīng)用原位雜交技術(shù)進(jìn)行標(biāo)記。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明，所述原位雜交技術(shù)包括英光原位雜交技術(shù)。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明，所述英光原位雜交技術(shù)包括單色英光原位雜交、多色英光原位雜交、 DNA纖維英光原位雜交或其組合。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明，所述顯微切割分離胎兒有核細(xì)胞包括使用激光捕獲顯微切割儀器進(jìn) 行單細(xì)胞分離。
[0023]目前沒有成熟的無創(chuàng)胎兒完整基因組的獲取技術(shù)，與現(xiàn)有的胎兒遺傳物質(zhì)獲取方 法（羊水穿刺取細(xì)胞及分離外周血游離DNA片斷）相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0024]1、無創(chuàng)性；產(chǎn)前取孕婦外周血，對(duì)胎兒無創(chuàng)傷，對(duì)孕婦的影響也極其輕微，而羊水 穿刺對(duì)胎兒及孕婦會(huì)造成諸多傷害；
[00巧]2、及早性：最早可在孕9周進(jìn)行遺傳檢測，對(duì)相關(guān)疾病可做到早發(fā)現(xiàn)早預(yù)防早治 療，而羊水穿刺一般要到15周W后胎兒發(fā)育足夠大W后才能進(jìn)行；
[0026] 3、經(jīng)濟(jì)實(shí)用性；現(xiàn)有的胎兒細(xì)胞富集方法存在操作過程繁瑣、價(jià)格昂貴、實(shí)用性較 差的缺陷，而本發(fā)明方法的成本和羊水穿刺及分離外周血游離DNA相當(dāng)，較W往胎兒全基 因組獲取方法更為簡單、經(jīng)濟(jì)、操作方便，具有廣泛的經(jīng)濟(jì)實(shí)用性和臨床推廣價(jià)值；
[0027] 4、精確性：將胎兒父親/母親外周血（含胎兒遺傳標(biāo)記）與母親體細(xì)胞進(jìn)行遺傳 標(biāo)記對(duì)比分析，利用差異性遺傳標(biāo)記進(jìn)行原位雜交的方法，可W從母親的外周血液中，精確 找出胎兒的單細(xì)胞，采用激光捕獲顯微切割技術(shù)直接獲得所需的單個(gè)細(xì)胞，從而得到胎兒 細(xì)胞的基因組，確保了胎兒細(xì)胞基因組DNA的來源和完整，避免了母源基因的干擾，保證診 斷結(jié)果的準(zhǔn)確性，而分離孕婦外周血的方法會(huì)受到母源基因的干擾，只能對(duì)特定的基因區(qū) 域或疾病進(jìn)行遺傳檢測；
[0028] 5、普適性：通過提取純化胎兒游離DNA或（和）RNA的方法，無法獲得完整的胎 兒基因組，而且容易為母源基因污染，此方法目前只能用于胎兒性別的檢測和特定基因的 檢測，羊水穿刺及分離外周血游離DNA只能對(duì)單一特定遺傳疾病進(jìn)行遺傳檢測，而本發(fā)明 能獲取源自胎兒的完整全基因組DNA，可進(jìn)行大量的單個(gè)和全基因組水平上的各類基因 值NA)分析、單基因病診斷、個(gè)體藥物耐受性、多基因病致病風(fēng)險(xiǎn)甚至細(xì)胞遺傳學(xué)分析（染 色體缺失及微缺失、重復(fù)、易位等重組）等遺傳診斷，無需為診斷不同的遺傳病而設(shè)計(jì)不同 的遺傳檢測方案；
[0029] 6、本發(fā)明僅需要少數(shù)幾個(gè)，或一個(gè)胎兒有核細(xì)胞就能完成胎兒基因組的提取，避 免了由于細(xì)胞數(shù)量不足導(dǎo)致的檢測失敗，不僅大大提高了產(chǎn)前檢查的成功率，更節(jié)省了資 源消耗。
[0030] 本發(fā)明可精確獲得胎兒來源的全基因組DNA，為無創(chuàng)性產(chǎn)前遺傳診斷應(yīng)用奠定了 物質(zhì)基礎(chǔ)，具有廣泛的應(yīng)用前景。
【具體實(shí)施方式】
[0031] W下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，W下實(shí)施例僅用于說明本 發(fā)明而非用于限制本發(fā)明的范圍。
[0032] W下實(shí)施例中母親和/或父親的體細(xì)胞來源自但不限于；頭皮屑、口腔上皮、孕前 母親的外周血等。
[0033] W下實(shí)施例中鑒定胎兒特有或父源特有（母源無）遺傳標(biāo)記的方法包括但不限 于基因芯片法、PCR測序法、MGB英光PCR法、限制性片斷長度多態(tài)性法、單鏈構(gòu)象多態(tài)性 法、變性梯度凝膠電泳法、飛行質(zhì)譜儀檢測法、變性高效液相色譜法等。
[0034] W下實(shí)施例中標(biāo)記胎兒有核細(xì)胞的方法包括但不限于應(yīng)用原位雜交技術(shù)，包 括單色英光原位雜交、多色英光原位雜交、DNA纖維英光原位雜交及英光原位雜交與 其他標(biāo)記技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用；標(biāo)記探針包括使用生物素度iotin)、地高辛（digoxigenin)、 dinitrophenyl(DNP)、aminoacetylfluorine(AA巧等方法。
[0035] 室施包U、無創(chuàng)性獲取胎兒完整基因組DNA的方法
[0036] 1. 1、母體外周血中單核細(xì)胞的分離
[0037] 取妊娠5~38周的母體（孕婦）外周靜脈血5~20ml,優(yōu)選妊娠10~17周， 最佳采血量為10ml，采用4mmol/L的邸TA抗凝，然后用磯酸鹽緩沖液（PBS，pH7. 4) 按1;1稀釋。在15ml的化Icon離必管內(nèi)，加入5ml細(xì)胞分離液His化paque"-1077(Sigma公司），沿著離必管壁緩慢加入上述稀釋的孕婦血10ml，使血液覆蓋在細(xì)胞分離液 Histopaque'S-1077上，400 X g室溫離必30min。吸取位于血漿和Histopaque?-】077之間的 單核細(xì)胞層，用PBS緩沖液（含5mmol/L邸TA和含體積分?jǐn)?shù)為0. 5%的BSA，pH7. 4)洗涂 1次，W大約每1〇7個(gè)細(xì)胞加80μLPBS緩沖液（pH7. 4)的比例制成單核細(xì)胞懸液。
[003引1. 2、制備單核細(xì)胞涂片
[0039] 吸取有核細(xì)胞懸液20μ1混勻后加在顯微切割帶膜載玻片有膜面左端的膜上，沿 有膜區(qū)將細(xì)胞均勻涂在