一種檢測鮮活農(nóng)產(chǎn)品中致病菌的五重pcr引物及探針和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及致病菌檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及一種檢測鮮活農(nóng)產(chǎn)品中致病菌的五重PCR引物及探針和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 鮮活農(nóng)產(chǎn)品是我國消費(fèi)者除糧食外最主要的食物營養(yǎng)來源，在日常生活中占據(jù)著 舉足輕重的位置。鮮活農(nóng)產(chǎn)品在原料，加工，儲藏，運(yùn)輸過程中容易受到多種病原微生物 (主要是細(xì)菌和真菌）的侵染。因微生物侵染產(chǎn)生的病害發(fā)生后的交叉感染會造成果蔬的 大量損失，失去商品價值，極大地限制了果蔬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。同時被各種病原微生物污染的鮮 活農(nóng)產(chǎn)品一旦被消費(fèi)者購買、食用會造成食物中毒，疾病傳播等嚴(yán)重后果，危害食品安全， 給消費(fèi)者的身體健康和生命安全帶來巨大威脅。
[0003]基因忍片檢測微生物的基本原理是在忍片表面合成待檢驗微生物的特異性核酸 探針，微生物樣品DNA經(jīng)巧光標(biāo)記PCR擴(kuò)增，然后再與忍片上寡核巧酸點雜交，最后通過掃 描儀分析巧光分布模式來確定檢測樣品是否存在某些特定微生物。與傳統(tǒng)的檢測方法（細(xì) 菌培養(yǎng)、生化鑒定、血清分型等）相比，基因忍片技術(shù)的先進(jìn)性主要體現(xiàn)在：①基因忍片可 W實現(xiàn)微生物的高通量和并行檢測，一次實驗即可得出全部結(jié)果；②操作簡便快速，整個檢 測只需24h基本可W出結(jié)果（而傳統(tǒng)方法一般需4~7d);③特異性強(qiáng)，敏感性高。
[0004] 多重PCR(multiplex PCR)是在普通PCR的基礎(chǔ)上加W改進(jìn)，于一個PCR反應(yīng)體 系中加入多對特異性引物，針對多個DNA模板或同一模板的不同區(qū)域擴(kuò)增多個目的片段的 PCR技術(shù)。采用運(yùn)一技術(shù)可同時擴(kuò)增多種病原微生物特異核酸序列，可大大提高病原微生物 的檢測效率。目前同時對食品或食源性疾病多種病原菌進(jìn)行分子診斷時常常采用多重PCR 方法，因為該方法可同時檢測3~4種病原菌，既提高檢測速度降又降低了檢驗成本，由此 得到廣泛應(yīng)用。但傳統(tǒng)的多重PCR體系中，由于存在多對引物，引物之間的干擾W及引物 與模板的錯配而造成靈敏度下降與非特異性擴(kuò)增反應(yīng)增加等問題，制約多重PCR技術(shù)的發(fā) 展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引本發(fā)明的目的在于提供一種檢測鮮活農(nóng)產(chǎn)品中致病菌的五重PCR引物，可同時檢 測沙口氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、大腸桿菌0-157和單核細(xì)胞增生李斯特菌等 5種致病菌，引物之間的干擾小，非特異性擴(kuò)增反應(yīng)少，保證了檢測的靈敏度與特異性，既提 高檢測速度降又降低了檢驗成本。
[0006]本發(fā)明還提供了檢測上述五重PCR引物擴(kuò)增產(chǎn)物的探針。
[0007]同時本發(fā)明還提供了檢測鮮活農(nóng)產(chǎn)品中致病菌的試劑盒。
[0008]本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：
[0009]-種檢測鮮活農(nóng)產(chǎn)品中致病菌的五重PCR引物，包括5對引物對，5對引物對分別 為：沙口氏菌正向引物，序列信息見SEQIDNo. 1所示，沙口氏菌反向引物序列信息見SEQ IDNo. 2 所示；
[0010] 金黃色葡萄球菌正向引物，序列信息見SEQIDNo. 3所示，金黃色葡萄球菌反向引 物序列信息見SEQIDNo. 4所示；
[0011] 大腸桿菌0-157正向引物，序列信息見SEQIDNo. 5所示，大腸桿菌0-157反向引 物序列信息見SEQIDNo. 6所示；
[0012] 副溶血弧菌正向引物，序列信息見SEQIDNo. 7所示，副溶血弧菌反向引物序列信 息見SEQIDNo. 8所示；
[0013] 單核細(xì)胞增生李斯特菌正向引物，序列信息見SEQIDNo. 9所示，單核細(xì)胞增生李 斯特菌反向引物序列信息見SEQIDNo. 10所示。
[0014] 本發(fā)明針對沙口氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、大腸桿菌0-157和單核細(xì) 胞增生李斯特菌，篩選出各個菌種種間特異性強(qiáng)同時種內(nèi)保守性強(qiáng)的基因區(qū)段設(shè)計引物。 引物特異性強(qiáng)，本發(fā)明特定設(shè)計的5對引物對，引物之間的干擾小，非特異性擴(kuò)增反應(yīng)少， 保證了檢測的靈敏度與特異性，既提高檢測速度降又降低了檢驗成本。
[001引一種用于檢測五重PCR引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的探針，包括5組探針，5組探針分別 為：
[0016] 檢測沙口氏菌的探針20個，序列見SEQIDNo. 132~151所示；
[0017] 檢測金黃色葡萄球菌的探針24個，序列見SEQIDNo. 108~131所示；
[001引檢測大腸桿菌0-157的探針25個，序列見沈QIDNo. 11~35所示；
[0019] 檢測副溶血弧菌的探針46個，序列見SEQIDNo. 62~107所示；
[0020] 檢測單核細(xì)胞增生李斯特菌的探針26個，序列見SEQIDNo. 36~61所示。
[002。 為了精確檢測細(xì)菌加強(qiáng)檢測效率，本發(fā)明針對五重PCR引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物設(shè)計 了特定的DNA探針，探針固定在基因忍片上，便于大通量、快速檢測，檢測精度高。一種檢測 鮮活農(nóng)產(chǎn)品中致病菌的檢測試劑盒，包括五重PCR反應(yīng)體系和具有針對5種致病菌設(shè)計的 DNA探針的原位合成忍片，所述五重PCR反應(yīng)體系W總體積50μL計，其組成如下：
[0022] lOXExTaqbuffer10μL,
[0023] 濃度為 2. 5mmol/L 的 dATP 1. 0 μL，
[0024] 濃度為 2. 5mmol/L 的 dTTP 1. 0 μL
[00巧]濃度為 2. 5mmol/L的dGTP1. 0μL
[0026] 濃度為 2. 5mmol/L 的 dCTP 0. 75μL，
[0027] 濃度為Inmol/μL 的 cy3_dCTP 2. 0 μL，
[0028] 引物混合物5.0μL，
[0029] DNA模板 20ng或lOng，
[0030] 濃度為抓/μL的ExTaq酶 0. 5μL
[0031] (1地2〇 補(bǔ)足至 50yL。
[0032] 本發(fā)明在反應(yīng)體系中滲入一定比例的cy3-dCTP是為了在PCR產(chǎn)物中滲入巧光素， 在后續(xù)的雜交反應(yīng)中，如果帶有巧光素的PCR產(chǎn)物與忍片上的探針成功雜交，則在雜交清 洗完畢后，W掃描儀對忍片進(jìn)行掃描時（掃描波長根據(jù)染料進(jìn)行選擇，比如cy3采用532nm) 成功雜交的探針位置會發(fā)巧光，從而可W得知樣品中是否存在探針對應(yīng)的細(xì)菌。
[0033] 本發(fā)明的試劑盒結(jié)合多重PCR技術(shù)和基因忍片技術(shù)，可同時檢測沙口氏菌、金黃 色葡萄球菌、副溶血性弧菌、大腸桿菌0-157和單核細(xì)胞增生李斯特菌等5種致病菌，該方 法具有準(zhǔn)確性高，靈敏度高，特異性強(qiáng)，高效快速等優(yōu)點。
[0034] 作為優(yōu)選，所述引物混合物的由W下引物混合而成：
[0035] 濃度為20mmol/L的沙口氏菌正向引物19 μL濃度為20mmol/L的沙口氏菌反向引 物19 μ L ;
[0036] 濃度為20mmol/L的金黃色葡萄球菌正向引物20μL濃度為20mmol/L的金黃色葡 萄球菌反向引物20μL;
[0037] 濃度為20mmol/L的大腸桿菌0-157正向引物7. 3μ L濃度為20mmol/L的大腸桿 菌0-157反向引物7.3μL;
[0038] 濃度為20mmol/L的副溶血弧菌正向引物20μL濃度為20mmol/L的副溶血弧菌反 向引物20化；
[0039] 濃度為20mmol/L的單核細(xì)胞增生李斯特菌正向引物20 濃度為20mmol/L的單 核細(xì)胞增生李斯特菌反向引物20μ L。
[0040] 作為優(yōu)選，針對5種致病菌設(shè)計的DM探針如下：
[0041] 檢測沙口氏菌的探針20個，序列見SEQIDNo. 132~151所示；
[0042] 檢測金黃色葡萄球菌的探針24個，序列見SEQIDNo. 108~131所示；
[0043] 檢測大腸桿菌0-157的探針25個，序列見沈Q ID No.11~35所示；
[0044] 檢測副溶血弧菌的探針46個，序列見SEQIDNo. 62~107所示；
[0045] 檢測單核細(xì)胞增生李斯特菌的探針26個，序列見SEQID No.36~61所示。
[0046] 本發(fā)明的有益效果是：五重PCR引物，可同時檢測沙口氏菌、金黃色葡萄球菌、畐U 溶血性弧菌、大腸桿菌0-157和單核細(xì)胞增生李斯特菌等5種致病菌，引物之間的干擾小， 非特異性擴(kuò)增反應(yīng)少，保證了檢測的靈敏度與特異性，既提高檢測速度降又降低了檢驗成 本。
【附圖說明】
[0047] 圖1是巧光多重PCR驗證結(jié)果圖；圖中：1、五種菌混合，2、副溶血弧菌（理論擴(kuò) 增長度44化p)3、沙口氏菌（理論擴(kuò)增長度93化p)，4、金黃色葡萄球菌（理論擴(kuò)增長度 547bp)，5、單核細(xì)胞增生李斯特菌（理論擴(kuò)增長度958bp)，6、大腸桿菌0-157 (理論擴(kuò)增長 度 350bp)，L、Marker。
[004引圖2是沙口氏菌巧光多重PCR產(chǎn)物雜交結(jié)果圖。
[0049] 圖3是金黃色葡萄球菌巧光多重PCR產(chǎn)物雜交結(jié)果圖。
[0050] 圖4是大腸桿菌0-157巧光多重PCR產(chǎn)物雜交結(jié)果圖。
[005。圖5是副溶血弧菌巧光多重PCR產(chǎn)物雜交結(jié)果圖。
[0052] 圖6是單核細(xì)胞增生李斯特菌巧光多重PCR產(chǎn)物雜交結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0053] 下面通過具體實施例，并結(jié)合附圖，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說明。
[0054]本發(fā)明中，若非特指，所采用的原料和設(shè)備等均可從市場購得或是本領(lǐng)域常用的。 下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。