改進(jìn)的細(xì)胞培養(yǎng)基的制作方法
【專利說明】
[0001] 本申請是申請人于2011年4月25日提交的題為"改進(jìn)的細(xì)胞培養(yǎng)基"的中國專 利申請201180021025. 4號的分案申請。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)的一般領(lǐng)域，尤其設(shè)及細(xì)胞的培養(yǎng)及其在W工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)多 膚中的用途。
[0003] 本發(fā)明提供具有高含量氯化膽堿的細(xì)胞培養(yǎng)基，其允許W高細(xì)胞存活率 (Vi油ility)培養(yǎng)細(xì)胞延長的時(shí)間。在用于通過W010細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)重組表達(dá)多膚來產(chǎn)生 多膚時(shí)（尤其是W工業(yè)規(guī)模來產(chǎn)生多膚時(shí)），本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)一步允許獲得高多膚 生產(chǎn)力和/或改善的產(chǎn)物質(zhì)量。
【背景技術(shù)】
[0004] 在過去二十年中，用重組技術(shù)制備多膚已發(fā)展為標(biāo)準(zhǔn)方法。通過克隆編碼各多膚 的基因、然后用該待表達(dá)的基因轉(zhuǎn)化適宜的表達(dá)宿主、最后產(chǎn)生和純化所獲得的重組多膚 產(chǎn)物來獲得重組多膚提供了一類全新的通過生物學(xué)設(shè)計(jì)和產(chǎn)生的藥物。
[0005] 在重組DNA技術(shù)后使用生物工程領(lǐng)域中發(fā)展的產(chǎn)生方法，制藥產(chǎn)業(yè)中已制備了數(shù) 目越來越多的藥物活性化合物。
[0006]運(yùn)類生物產(chǎn)物包括單克隆抗體，其已發(fā)展為包括自身免疫病、炎性障礙、免疫抑 審IJ、腫瘤學(xué)等的多種醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中重要的治療選擇。
[0007] 運(yùn)類生物來源藥物的發(fā)展需要W工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)，從而提供大量重組多膚。優(yōu)選的 表達(dá)系統(tǒng)是哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物，其優(yōu)于大多數(shù)其他基于昆蟲細(xì)胞、酵母等的真核系統(tǒng)，或 甚至傳統(tǒng)的原核表達(dá)系統(tǒng)。
[0008] 但是，尤其是在工業(yè)規(guī)模，哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)包括巨大的挑戰(zhàn)。用于哺乳動物細(xì)胞 培養(yǎng)的生產(chǎn)設(shè)施需要徹底優(yōu)化許多方法條件。
[0009]用于控制總體產(chǎn)生方法的最重要的方法參數(shù)之一是在其中培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基。適 宜的細(xì)胞培養(yǎng)基必須為細(xì)胞培養(yǎng)物提供所有必需營養(yǎng)物，運(yùn)在不向培養(yǎng)基中加入動物來源 的成分（如血清或蛋白質(zhì)，例如生長因子）時(shí)尤其困難。
[0010] 另外，哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物在多膚產(chǎn)生方法的不同階段需要特定的補(bǔ)充成分。因 此，細(xì)胞培養(yǎng)基必須在W下期間提供必需底物：a)宿主細(xì)胞在較低密度下起始生長和增 殖；b)隨后培養(yǎng)細(xì)胞至高密度；C)多膚在培養(yǎng)細(xì)胞中形成的實(shí)際過程。
[0011] 用于產(chǎn)生重組多膚的總體方法優(yōu)選包括擴(kuò)大期和生產(chǎn)期。在擴(kuò)大期期間，通過使 用生長培養(yǎng)基來將宿主細(xì)胞培養(yǎng)至高密度，W最大化隨后的多膚產(chǎn)生。在生產(chǎn)期期間，通過 使用生產(chǎn)培養(yǎng)基來達(dá)到希望的多膚的大量的實(shí)際形成。為了滿足細(xì)胞在總體多膚產(chǎn)生方法 的各階段中的具體的代謝需要，分別為擴(kuò)大期和生產(chǎn)期設(shè)計(jì)了不同的培養(yǎng)基組合物。例如， 生產(chǎn)培養(yǎng)基通常包含量比生長培養(yǎng)基高的氨基酸。
[0012] 因此，過去已進(jìn)行了大量的努力來研發(fā)特別強(qiáng)調(diào)它們在多膚的大規(guī)模產(chǎn)生中的用 途的細(xì)胞培養(yǎng)基。然而，細(xì)胞培養(yǎng)基的持續(xù)改進(jìn)仍然是重要目標(biāo)，w進(jìn)一步就產(chǎn)物質(zhì)量和數(shù) 量產(chǎn)率最大化多膚產(chǎn)生。
[0013] 過去已就其在多膚產(chǎn)生中的作用研究了細(xì)胞培養(yǎng)基的許多成分?？赡艿撵霕?biāo)是無 機(jī)鹽、氨基酸、碳源（如葡萄糖）或維生素。
[0014] 例如，已顯示補(bǔ)充如維生素、氯化膽堿或氨基酸的化合物可W增加在無蛋白質(zhì)條 件下培養(yǎng)的細(xì)胞的存活率和生產(chǎn)力化im do Y等，切totechnology 2005,47,37-49)。
[0015] 氯化膽堿是細(xì)胞培養(yǎng)基的標(biāo)準(zhǔn)成分，其作為細(xì)胞的憐脂前體。被細(xì)胞攝取并加工 后，它作為細(xì)胞膜中除憐脂酷乙醇胺和憐脂酷肌醇外的稱為憐脂酷膽堿的主要憐脂之一終 止。
[001 引 如D-MEM值U化ecco'SModified Eagle Medium)和D-MEM/F-12的常用細(xì)胞培養(yǎng) 基已廣泛用于培養(yǎng)廣范圍的哺乳動物細(xì)胞系。運(yùn)些培養(yǎng)基分別包含4mg/L和8.98mg/L的 氯化膽堿量。
[0017] 其他市售培養(yǎng)基，如Ham'SF-12 (可從BioConcept購得）和MEM(可從HyClone 購得）也分別包含13. 96mg/L和56mg/L的低量氯化膽堿。
[0018]US6, 180,401公開了改進(jìn)的用于在動物細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生多膚的方法。一個(gè)目 標(biāo)是增加終產(chǎn)物濃度。修改了包括葡萄糖濃度、重量摩爾滲透壓濃度（osmolality)和谷氨 酷胺濃度的幾個(gè)參數(shù)來最大化生產(chǎn)期中的產(chǎn)物產(chǎn)率。US6, 180, 401公開了具有50.86mg/L 的氯化膽堿含量的細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0019]US5, 122,469公開了用于繁殖多種哺乳動物細(xì)胞系，尤其是中國倉鼠卵巢細(xì)胞 (CH0)的培養(yǎng)基，其允許W適合用于哺乳動物細(xì)胞的小規(guī)模和大規(guī)模繁殖的單層或懸浮形 式高密度培養(yǎng)細(xì)胞。另一個(gè)優(yōu)勢是增強(qiáng)的產(chǎn)物產(chǎn)率。該培養(yǎng)基是包含提高水平的某些氨基 酸的化學(xué)成分確知培養(yǎng)基。氯化膽堿含量是50.86mg/L。
[0020] 現(xiàn)有技術(shù)中僅已知很少幾種具有高氯化膽堿含量的培養(yǎng)基。Waymouth描述了可 W用來培養(yǎng)小鼠L929成纖維細(xì)胞結(jié)締組織細(xì)胞系的細(xì)胞培養(yǎng)基杞Waymouth，J.化tl. Cancer.Inst.，1959, 22, 1003-1017)。此培養(yǎng)基是無血清、化學(xué)成分確知的合成培養(yǎng)基， 且具有250mg/L的氯化膽堿含量。此培養(yǎng)基WWaymouth'SMediumMB752/1名稱購得 (BioConcept和Sigma-Al化ich)。已知的適用性限于全器官培養(yǎng)、從胸腔積液（pleural effusion)建立癌細(xì)胞系、W及在其體內(nèi)評估前培養(yǎng)可能致瘤的細(xì)胞。
[0021] W0 02/101019公開了分別具有101. 72mg/L和209. 40mg/L的相對高的氯化膽堿 含量的兩種培養(yǎng)基組合物。用運(yùn)些培養(yǎng)基來研究谷氨酷胺和谷氨酸對重組蛋白質(zhì)產(chǎn)生的影 響。但是，兩種培養(yǎng)基都仍包含高量的谷氨酷胺。
[0022] 從現(xiàn)有技術(shù)僅可獲得關(guān)于培養(yǎng)基中的氯化膽堿含量對多膚產(chǎn)生的作用的有限的 信息。US6, 048, 728簡要討論了細(xì)胞培養(yǎng)基中的氯化膽堿含量對用雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生生物 產(chǎn)物的作用。在表達(dá)抗體的細(xì)胞的情況下，在包含與PrimarySupplement的其他試劑組合 的高于4mg/L且優(yōu)選約4至75mg/L的膽堿補(bǔ)充物的培養(yǎng)基中觀察到了最大量的抗體分泌。 在運(yùn)些濃度下，將膽堿描述為非限制性的，且無明顯毒性。
[0023] 生產(chǎn)用細(xì)胞培養(yǎng)基，尤其是設(shè)計(jì)用于重組多膚的工業(yè)大規(guī)模產(chǎn)生的那些需要增加 量的成分，例如氨基酸。
[0024] 但是，高度濃縮的細(xì)胞培養(yǎng)基顯示選定培養(yǎng)基成分的有限的溶解度。有限的溶解 度代表了技術(shù)上的不足，因?yàn)橛糜诖笠?guī)模生產(chǎn)的高度濃縮的培養(yǎng)基具有單個(gè)成分例如在生 產(chǎn)期期間，尤其是在保存期間沉淀的風(fēng)險(xiǎn)。運(yùn)可W導(dǎo)致培養(yǎng)基組成的變化及細(xì)胞培養(yǎng)條件 在產(chǎn)物形成的關(guān)鍵點(diǎn)劣化。
[0025] 作為進(jìn)一步的結(jié)果，沉淀導(dǎo)致從實(shí)際產(chǎn)生方法有效地去除了寶貴的培養(yǎng)基成分。 設(shè)計(jì)用于克服運(yùn)類缺點(diǎn)的附加再循環(huán)方法在技術(shù)上難W實(shí)現(xiàn)，就資源和時(shí)間而言需要進(jìn)一 步的努力。在多膚產(chǎn)生中同等地有效時(shí)，濃縮程度較低的細(xì)胞培養(yǎng)基可允許在工業(yè)生產(chǎn)方 法中達(dá)到顯著的成本降低。
[0026] 鑒于W上挑戰(zhàn)和現(xiàn)有不足，工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域中存在對改進(jìn)的培養(yǎng)基的持續(xù)需 要，該培養(yǎng)基允許W甚至更高的產(chǎn)率（即，改善的比生產(chǎn)力（specificpro化ctivity)和總 體生產(chǎn)力及提高的產(chǎn)物質(zhì)量）W工業(yè)規(guī)模產(chǎn)生重組多膚。尤其希望得到改進(jìn)的細(xì)胞培養(yǎng)基 來改善生產(chǎn)期期間的生產(chǎn)力。
[0027]多膚產(chǎn)生方法的一個(gè)具體的技術(shù)目標(biāo)是在產(chǎn)生方法結(jié)束時(shí)保持更高的細(xì)胞存活 率，W最大化多膚的最終產(chǎn)率，尤其是由于產(chǎn)生時(shí)間的延長。此外，減少所形成的重組多膚 的聚集及尤其是就翻譯后修飾（如糖基化模式）改善產(chǎn)物質(zhì)量也是重要的技術(shù)目標(biāo)。
[0028] 最后，希望得到用于多膚的大規(guī)模產(chǎn)生的改進(jìn)的生產(chǎn)培養(yǎng)基，其包含降低量的成 分，同時(shí)就細(xì)胞生長、多膚生產(chǎn)力、重組多膚質(zhì)量和多膚功能性而言同等地有效或甚至更 好。
[002引發(fā)明概述
[0030] 為了克服上文提到的技術(shù)挑戰(zhàn)，本發(fā)明提供具有高含量氯化膽堿的細(xì)胞培養(yǎng)基， 其尤其是在生物技術(shù)產(chǎn)生方法的后期導(dǎo)致細(xì)胞比生產(chǎn)力和細(xì)胞存活率的意外改善。此外， 使用該細(xì)胞培養(yǎng)基還可W令人驚奇地改善重組產(chǎn)物的質(zhì)量。本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基尤其適于 在生產(chǎn)期期間使用。因此，本發(fā)明允許從CK)細(xì)胞產(chǎn)生重組多膚。
[0031] 該細(xì)胞培養(yǎng)基尤其可W用作生產(chǎn)培養(yǎng)基來在生產(chǎn)期期間達(dá)到高細(xì)胞生長、高活細(xì) 胞密度和高多膚效價(jià)。還發(fā)現(xiàn)，可W通過使用本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基來改善就較少的聚集和 /或更好的翻譯后修飾而言的產(chǎn)物質(zhì)量，如重組產(chǎn)物的改善的糖基化模式。
[0032] 在本發(fā)明中，優(yōu)選使用氯化膽堿。但是，其他膽堿來源，例如氨氧化膽堿、酒石酸/ 酒石酸氨膽堿、硫酸膽堿、憐酸膽堿或基于不同平衡離子的使用的任意其他膽堿化合物也 適合用于本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基中。如果使用運(yùn)類其他膽堿化合物，則優(yōu)選選擇它們的量來 達(dá)到與用上文給出的濃度范圍和濃度值的氯化膽堿達(dá)到的摩爾膽堿濃度相同的摩爾膽堿 濃度，即，其他膽堿鹽優(yōu)選W等同于所列出的氯化膽堿濃度的濃度存在。運(yùn)也適用于下文提 到的具體的方面和實(shí)施方案。
[0033] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供具有