用于環(huán)境真菌生物多樣性高通量測序的復(fù)合標(biāo)簽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基因測序技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種用于環(huán)境真菌生物多樣性高通量測 序的復(fù)合標(biāo)簽，用于超高通量基因測序。
【背景技術(shù)】
[0002] 微生物群落多樣性是微生物生態(tài)學(xué)和環(huán)境學(xué)研究的重點(diǎn)之一。目前利用宏基因組 研究微生物多樣性越來越受到科學(xué)家們的關(guān)注，但由于對于同一個(gè)樣本來說，宏基因組研 究的結(jié)果中往往細(xì)菌的數(shù)量占大多數(shù)而使得真菌等微生物種類遠(yuǎn)少于細(xì)菌。運(yùn)對于某些領(lǐng) 域的研究非常不利，如對釀酒過程中各個(gè)時(shí)期的微生物種群研究，真菌的作用遠(yuǎn)高于細(xì)菌， 對酒類品質(zhì)的影響較大。因此利用真菌獨(dú)特的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列為祀序列，用PCR擴(kuò)增的 方法從復(fù)雜樣本中富集真菌DNA成為非常有效的方法。
[0003] Handelman(HandelsmanJ,RondonMR,BradySF.molecularbiologialaccess tothechemistryofunkownsoilmicrobes:Anewfrontierfornaturalproducts[J ].1998, 5(10) :R245-R249.)等（1998)首次提出宏基因組的概念，其定義為"thegenomes ofthetotalmicrobiotafoundinna1:ure"，即環(huán)境中全部微小生物遺傳物質(zhì)的總和。它 包含了可培養(yǎng)的和未可培養(yǎng)的微生物的基因組總和。本發(fā)明所指的宏內(nèi)間隔序列是指環(huán)境 中全部真菌內(nèi)間隔序列的總和，為微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作 關(guān)系及與環(huán)境之間的關(guān)系為研究目的提供了一條新的思路。
[0004] 核糖體RNA(rRNA)由于功能上高度保守，序列上不同位置具有不同的變異速率， 是目前在微生物分子生態(tài)學(xué)上應(yīng)用最廣泛的分子標(biāo)記。真核生物基因組中編碼核糖體RNA 的基因包括28SrDNA、5SrDNA、18SrDNA和5. 8SrDNA4種，它們在染色體上頭尾相連、串 聯(lián)排列，相互之間由間隔區(qū)分隔（匡治州，許楊.核糖體rDNAITS序列在真菌學(xué)研究中的 應(yīng)用口].生命的化學(xué)，2004(02):120-122.)。其中185、5.85和285扣臟基因組成一個(gè)轉(zhuǎn) 錄單元，Ξ者高度保守，適合于較高等級水平的生物群體間的系統(tǒng)分析，其間的間隔區(qū)為 內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal^TranscribedSpacer,ITS)，包括18S和5. 8S之間的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔 區(qū)l(ITSl)及5. 8S和28S之間的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2QTS2)兩部分，由于ITS不加入成熟核 糖體，所W受到的選擇壓力較小，進(jìn)化速率較快，在絕大多數(shù)的真核生物中表現(xiàn)出了極為廣 泛的序列多態(tài)性。同時(shí)ITS序列長度適中，從人類到酵母的各種真核生物中ITS的序列長 度為lOOObp到小于300bp大小不等，人們可W從不太長的序列中獲得足夠的信息，可廣泛 用于屬內(nèi)種間或種內(nèi)群體的系統(tǒng)學(xué)研究（IwenPC,HinrichsSH,Ru卵ΜE.化ilization oftheintern曰1transcribedsp曰cerregions曰smolecul曰rt曰rgetstodetect曰nd identifyhumanfungalpathogens[J].MedMycol, 2002, 40(1):87-109)。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽〇化]本發(fā)明提供一種用于環(huán)境真菌生物多樣性高通量測序的復(fù)合標(biāo)簽及其應(yīng)用，提高 超高通量測序的樣本通量，有效降低超高通量測序成本，有效富集樣本中整個(gè)微生物種群 中的真菌種群，為探明環(huán)境中真菌多樣性研究提供高通量分析途徑。 陽006] -種用于環(huán)境真菌生物多樣性高通量測序的復(fù)合標(biāo)簽，其序列如如下序列編號 NO. 1 ~NO. 48 所示。
[0007] 本發(fā)明復(fù)合標(biāo)簽的每一條序列由左側(cè)8-10個(gè)堿基組成具唯一性標(biāo)簽和右側(cè)21個(gè) 源于真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1的序列組成的標(biāo)簽復(fù)合而成。
[0008] 表 1
[0009] 陽010」

[0011] 本發(fā)明還提供一種真菌高通量基因測序方法，包括如下步驟： 陽〇1引 （1)提取每一個(gè)樣本的總DNA;
[0013] (2)對每一個(gè)樣本，從權(quán)利要求1中所示48對且未被選擇過的序列中選擇任一一 對序列作為引物，對對應(yīng)樣本的總DNA進(jìn)行擴(kuò)增；
[0014] (3)對每一個(gè)樣本的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化回收；
[0015] (4)對每個(gè)樣本純化回收后的產(chǎn)物紫外分光光度計(jì)精確定量；
[0016] (5)將所有樣本等量混合后建立一個(gè)測序文庫；
[0017] (6)對所建測序文庫進(jìn)行高通量測序。
[0018] 本發(fā)明所述真菌宏內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列是指所有落在真菌18S和5. 8S之間的內(nèi)轉(zhuǎn) 錄間隔區(qū)1的總和，復(fù)合標(biāo)簽如表1所示；利用表1的真菌宏內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列復(fù)合標(biāo)簽可 達(dá)到在一次超高通量測序中同時(shí)對1~48個(gè)樣本中的真菌宏內(nèi)間隔序列進(jìn)行檢測。
[0019] 利用目前超高通量測序自身提供96種測序標(biāo)簽（8-10個(gè)堿基），可做96個(gè)樣本， 但在超高通量測序前先對96個(gè)樣本分別建96個(gè)測序庫，然后等量混合成1個(gè)再同時(shí)測序， 而本發(fā)明只需建1個(gè)測序庫就能對48個(gè)樣本同時(shí)測序。如果將測序自帶的96個(gè)標(biāo)簽和本 發(fā)明的48個(gè)復(fù)合標(biāo)簽結(jié)合使用，則同時(shí)可對96*48個(gè)樣本的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔序列進(jìn)行超高通量 測序。
[0020] 步驟（1)中對每個(gè)樣本總DNA提取采用通用提取方法。
[0021] 步驟（2)中對每一個(gè)樣本從表1所示48對且未被選擇過的序列中選擇任一一對 序列作為引物，其選擇原則具體為：確定每一樣本的編號，對每一個(gè)編號樣本，從表1中選 擇一序列編號所對應(yīng)的序列1和序列2 (NO. 1的序列1和序列2為一對，NO. 2的序列1和 序列2為一對，NO. 3的序列1和序列2為一對W此類推），確定每一個(gè)樣本的一對序列；每 個(gè)編號的樣本可選表1中48對中的任何一對，但要求不同編號的樣本之間從表1選擇時(shí)不 要重合，即不同編號樣本不選擇同一個(gè)復(fù)合標(biāo)簽。 陽〇2引步驟似中對對應(yīng)樣本的總DNA進(jìn)行擴(kuò)增的擴(kuò)增體系為：
[0023] PCR擴(kuò)增的 50μΙ體系中含：50ng樣本總DNA，4yLMg2+，5yL10XBuffer，4yL濃 度為5nmoldNTP，1.抓Taq酶，濃度為lOpmol引物各1. 5μL補(bǔ)水至50μL。
[0024] ?〇?擴(kuò)增程序：94°(：預(yù)變性5111111，94°(：變性303,40°(：復(fù)性303,72°(：延伸1111111，30 個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸5min，4°C保存。
[00巧]步驟（3)中對每個(gè)樣本擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化回收采用通用的PCR產(chǎn)物回收試劑盒。
[0026] 本發(fā)明所述高通量測序采用基于IonPGM第二代超高通測序儀的測序平臺進(jìn)行。
[0027] 優(yōu)選地，步驟（5)中建庫所用建庫試劑盒為IonPGM第二代超高通測序儀對應(yīng)的 IonXpress?PlusgDNAFragmentLibraryPreparation試劑盒。
[002引步驟（6)中測序時(shí)擴(kuò)增所用擴(kuò)增試劑盒為IonPGM第二代超高通測序儀對應(yīng)的IonPGM?Template0T2400Kit試劑盒。
[0029] 步驟（6)中測序時(shí)測序所用測序試劑盒為IonPGM第二代超高通測序儀對應(yīng)的 IonPGMSequencing400Kit試劑盒。
[0030] 所述樣本為含真菌的樣本。
[0031] 與現(xiàn)有方法相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0032] 環(huán)境中（如±壤）棲居著大量的微生物，運(yùn)些微生物的分布及其活動(dòng)與±壤營養(yǎng) 條件，地上植被密切相關(guān)。濕地與森林、海洋并稱全球Ξ大生態(tài)系統(tǒng)，被稱為"地球之腎"，具 有豐富的生物多樣性。本方法W特定環(huán)境中的微生物為研究對象，基于宏基因組學(xué)的研究 思路，采用本方法所述的序列，建一個(gè)庫最多可對48個(gè)樣本同時(shí)進(jìn)行超高通量測序，進(jìn)行 基于宏基因組的環(huán)境樣本中的真菌種群變化規(guī)律研究，為各種環(huán)境樣本進(jìn)行同類研究提供 方法。
【附圖說明】
[0033] 圖1是本發(fā)明其中一個(gè)樣本電泳檢測結(jié)果圖。
[0034] 圖2是8個(gè)樣本的超高通量測序結(jié)果總覽。
【具體實(shí)