產(chǎn)物，所W標準樣品的濃度必須使用摩爾濃度，被測樣品測定出來的結果也是摩爾濃 度或W分子個數(shù)來反映。如此定量的結果屬于絕對定量。5個口的純質(zhì)粒樣本按照質(zhì)粒DNA 提取試劑盒的要求提取，洗脫體積100微升。質(zhì)粒原液進行倍比稀釋（每次稀釋10倍）作 為各個口qPCR定量的標準。特異性的擴增保證qPCR產(chǎn)物的融解曲線只有一個單峰或融解 溫度非常接近（相差一般不超過5度）的一組峰；按照本專利技術的口特異性引物設計， 通過對該擴增產(chǎn)物的克隆測序可W看到擴增產(chǎn)物都是目標口的種屬。擴增產(chǎn)物的特異性和 口特異性標準樣品的配置將可W保證qPCR定量的有效性。每個口的定量由每個口自己的 質(zhì)粒作為定量標準，而口特異性引物保證擴增產(chǎn)物為目標口的種屬序列，如此便可W保障 qPCR定量的有效性。5個口的上述定量可W分別做，測試條件穩(wěn)定后通過降低重復樣本的 次數(shù)等手段也可W在同一次qPCR中一起做，W便可W-次完成5個口或更多個口的定量， 繼而快速得到微生物群落結構的定量結果。如果設及的微生物群落的口的個數(shù)比較多，比 如7-12個，或者需要測定的樣本較多，則可W考慮使用384孔板和排槍加樣。
[0081] 5.利用擬桿菌口特異性引物對某品牌白酒四種魯泥樣本進行擬桿菌口的定量比 較。擬桿菌口引物特異引物擴增長度約約為185堿基對。
[0082] (一）Bacteroidetes口的質(zhì)粒梯度10倍稀釋：取質(zhì)粒母液2μL加入到18μL d地20中充分混勻，滿旋離屯、混合重復2次，得到10 1級倍比稀釋，如此下去，分別得到10 2、 10 3、1〇 4、1〇 5、1〇 6、1〇 7、1〇 8。
[008引（二）配制Mixl: (12μL體系）10 3-10S化個）
[0084] ΝΡΚ62CGREDB10) 6X45μΙ_=270μLPrimers(2uMeach) i.6X45 !止=72 叫
[0085] 化qI梅(5U/uL) 0.2 乂 45μL=9.0μL ddH2〇 3.2 乂 45μL一=144.0mL
[0086] 加完Taq酶后滿旋離屯、混合重復兩次
[0087] (Ξ)配制全部樣品各自的Mix2:103、104、105、106、107、108、待測樣品 ①②③④、NTC(陰性對照，不加模板）；（共11個）上述每個樣品都做一個自己的Mix2 (足 夠重復3次）如下：
[0088] Mixl：11X3. 5μΙ= 38. 5μL
[0089]樣品各自模板：1X3. 5μΙ= 3. 5μΙ
[0090] W上操作均要在冰浴中進行。11個樣品均滿旋離屯、混合重復兩次。
[0091](四）QPCR八聯(lián)管上樣
[0092]
防)9引按照設定好的step-one QPCR程序進行實驗并導出定量標準曲線?；境绦蛉?下：
[0094]
[0095](五）實驗結果與分析：
[0096] 標準質(zhì)粒母液DNA分子濃度為75649000X108Copy/l，稀釋梯度如下：
[0097]
[0100] 利用上述相同程序?qū)ヰB(yǎng)菌口進行定量測定，擴增長度約為208堿基對。
[0101] 互養(yǎng)菌口標準質(zhì)粒母液DNA分子濃度經(jīng)測定為67323000X108Copy/l，稀釋梯度如 下：
[0102] LU1U3」 巧巧訂昇護J泌卿歡度：
[0104]
[0105] 利用上述相同程序?qū)Ψ啪€菌口進行定量測定，擴增長度約為157堿基對。
[0106] 放線菌口標準質(zhì)粒母液DNA分子濃度經(jīng)測定為1134140X1〇8Copy/l，稀釋梯度如 下：
[0107]
[010引樣品計算的絕對濃度：
[0109]
[0110] 利用上述相同程序?qū)癖诰谶M行定量測定，擴增長度約為135堿基對。
[0111] 厚壁菌口標準質(zhì)粒母液DNA分子濃度經(jīng)測定為195071744X10化〇口7/1，稀釋梯度 如下：
[0112]
[0113] 樣品計算的絕對濃度：
[0114]
[0115] 利用上述相同程序?qū)ψ冃尉谶M行定量測定，擴增長度約為264堿基對。
[0116] 變形菌口標準質(zhì)粒母液DNA分子濃度經(jīng)測定為3666710Xl〇i°Copy/l，稀釋梯度如 下：
[0117]
[011引樣品計算的絕對濃度：
[0119]
[0120] 依據(jù)上述流程測試可W獲得圖1所示的四類魯泥的五個口的微生物群落結構定 量結果，各個口的QPCR定量耗時控制在2小時左右完成，由圖1看出：魯泥樣A，其中兩個 口即Syn和Act的物種含量很少；魯泥樣B，其與魯泥樣C的群落結構比較接近，物種含量 比較豐富；魯泥樣D，其中放線菌口Act含量較少。
【主權項】
1. 一種快速測定白酒發(fā)酵過程中微生物群落組成的方法，其特征是：通過在PCR反應 體系中使用門特異性引物達到白酒發(fā)酵過程中對具體某個門的微生物菌群進行特異性擴 增，并使用qPCR體系進行定量擴增，獲得定量識別。2. 根據(jù)權利要求1所述的快速測定白酒發(fā)酵過程中微生物群落組成的方法，其特征 是：按如下步驟制備門特異性引物： 步驟a、提取釀酒微生物群落樣本的宏基因組作為聚合酶鏈式反應擴增模板； 步驟b、擴增所述擴增模板中的核糖體DNA接近全長16srDNA序列，擴增引物為 27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和 1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）， 獲得擴增產(chǎn)物； 步驟c、對于所述擴增產(chǎn)物經(jīng)過純化后依次進行TA克隆、藍白斑篩選及白斑菌落雙向 測序，獲得不少于200個的有效克隆，所述有效克隆是指最后的雙向測序序列經(jīng)過序列比 對確實屬于16srDNA序列； 步驟d、對于所述有效克隆雙向測序序列通過進化樹分析，完成引物設計。3. 根據(jù)權利要求1所述的快速測定白酒發(fā)酵過程中微生物群落組成的方法，其特征 是： 對所述qPCR體系的配置：是使用qPCR試劑盒及qPCR儀器，并要求qPCR儀器可以檢測 對應試劑盒包含的熒光物質(zhì)，所述熒光物質(zhì)包括EvaGreen和SYBRgreen; 對于所述qPCR體系的條件的設定與運行；依據(jù)不同微生物群落和不同的門進行擴增 條件的調(diào)整優(yōu)化，定量識別同一個群落的不同的門時設計的引物盡量具備相近的Tm值，以 便在相同的擴增條件進行測試和應用； 對于所述qPCR體系的產(chǎn)物的檢測：在方法建立過程中，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增 產(chǎn)物的純度和質(zhì)量；在擴增產(chǎn)物達到單一主帶且Tm值分析具備單一產(chǎn)物峰時，不再需要跑 膠檢測產(chǎn)物，使用時qPCR只需要通過Tm值分析判斷即可，利用qPCR儀器同時導出qPCR擴 增曲線、定量結果及Tm值分析結果。4. 根據(jù)權利要求1所述快速測定白酒發(fā)酵過程中微生物群落組成的方法，其特征是： 所述門特異性引物為擬桿菌門特異性引物，其引物對核苷酸序列為： 320(5'-CGCACGGGTGAGTAACACGTAT-3'），321(5'-GGGGATAAATCCTCTCAGTTC CCCT-3，）； 所述門特異性引物或為變形菌門的特異性引物，其引物對核苷酸序列為： 317(5'-CCGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATAA-3'），319(5'-CACGCTTTACGCCCA GTAATTCCYA-3'）； 所述門特異性引物或為厚壁菌門的特異性引物，其引物對核苷酸序列為： J1 (5,-CAGCAGTGGGGAATCTTCC-3'），J2 (5,-TAGCCGGGGCTTCCTCCT-3'）； 所述門特異性引物或為互養(yǎng)菌門特異性引物，其引物對核苷酸序列為： J7 (5,-AMCCGCTTTCAGCAGGGAC-3,），J8 (5,-TAACTCCCGACCAAACAAGC-3'）。 所述門特異性引物或為放線菌門特異性引物，其引物對核苷酸序列如下所示： J9(5'-AGCGAACGGGATTAGATACCCC-3'），J10(5'-AGGTAAGGTTCTTCGGTTTGC A-3'）。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種快速測定白酒發(fā)酵過程中微生物群落組成的方法，其特征是通過在PCR反應體系中使用門特異性引物達到白酒發(fā)酵過程中對具體某個門的微生物菌群的特異擴增，并使用qPCR體系進行定量擴增，獲得定量識別。本發(fā)明根據(jù)已知微生物門類，分別設計了擬桿菌門，變形菌門，厚壁菌門，互養(yǎng)菌門和放線菌門的引物，基于門特異性引物的定量擴增可以在門的層面上快速考察白酒發(fā)酵過程中微生物群落的宏觀結構變化。
【IPC分類】C12R1/01, C12Q1/68, C12Q1/06
【公開號】CN105331702
【申請?zhí)枴緾N201510766757
【發(fā)明人】何宏魁, 周慶伍, 李安軍, 羅錫梅, 張會敏, 劉國英, 曹潤潔, 湯知輝, 張治洲
【申請人】安徽瑞思威爾科技有限公司
【公開日】2016年2月17日
【申請日】2015年11月5日