結(jié)構(gòu)復(fù)雜（重復(fù)的堿基多，或者有 其非重復(fù)堿基的插入）將會對后續(xù)分析帶來一定的偏差；其次，微衛(wèi)星位點(diǎn)所在的位置應(yīng) 該遠(yuǎn)離基因編碼區(qū)，如果處于或接近基因編碼區(qū)，運(yùn)些位點(diǎn)就可能會在種群的傳代過程中 丟失，不能真實(shí)地反映群體的遺傳特征；第Ξ，所選取的微衛(wèi)星位點(diǎn)原始序列要具有高度的 特異性。此外，在被研究樣本大小的選擇上也有很高的要求，如果選取的樣本數(shù)量太小，可 能會失去一些等位基因，從而給樣本之間遺傳差異的計算帶來偏差。因此，合適的微衛(wèi)星序 列位點(diǎn)的選擇需要經(jīng)過大量的分析和試驗(yàn)工作。而引物選擇主要是考慮W下幾個方面，首 選是確定引物的多態(tài)性，并參考W下標(biāo)準(zhǔn)：應(yīng)為公共所有，微衛(wèi)星座位間不連鎖，微衛(wèi)星座 位遺傳符合孟德爾遺傳規(guī)律，每個微衛(wèi)星座位至少應(yīng)有4個等位基因。此外，綜合考慮微 衛(wèi)星座位的引物序列組成，多態(tài)性和產(chǎn)物大小等多方面因素。從基因組數(shù)據(jù)庫獲取初始數(shù) 據(jù)，并經(jīng)過如下原則的篩選：a) 3-4個堿基重復(fù)（例如CGG，TACC) ;b)各位點(diǎn)不包含復(fù)雜結(jié) 構(gòu)；C)序列為中華整基因組特異；d)微衛(wèi)星的重復(fù)次數(shù)在10-25次；e)位點(diǎn)所處的位置應(yīng) 該遠(yuǎn)離編碼區(qū)。
[0039] 本發(fā)明人經(jīng)過轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq)即高通量RNA測序，運(yùn)種測序方法是將物種 總的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，將其打斷并連接特異接頭，將己連接了接頭的DNA片段結(jié)合 在含有接頭的忍片上并固定，每條分子經(jīng)擴(kuò)增成為一個單分子簇測序模板，加入不同巧光 標(biāo)記的脫氧核巧酸，采用邊合成邊測序法測序，轉(zhuǎn)錄組測序具有通量高、精度高、覆蓋范圍 廣等特點(diǎn)，能夠在單核巧酸水平檢測任意物種的整體轉(zhuǎn)錄活動，還可W發(fā)現(xiàn)未知轉(zhuǎn)錄本及 稀有轉(zhuǎn)錄本，另外，轉(zhuǎn)錄組測序具有很高的檢測通量，對于基因組和轉(zhuǎn)錄組信息都比較缺乏 的物種，通過轉(zhuǎn)錄組測序，不僅能提供大量的候選功能基因，同時也是快速獲得大量基因序 列資源的新方法，可為微衛(wèi)星序列、SNP等分子標(biāo)記的開發(fā)提供豐富的序列基礎(chǔ)。
[0040] 因此，本發(fā)明人對上述中華整進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測序，并進(jìn)行微衛(wèi)星序列捜索，然 后針對每一個微衛(wèi)星位點(diǎn)設(shè)計微衛(wèi)星引物；對上述獲得的微衛(wèi)星引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增及多態(tài)性 引物篩選，其中篩選條件是微衛(wèi)星序列長度最短為15bp，產(chǎn)物大小介于150bp到350bp之 間，預(yù)擴(kuò)增模板DNA來自于上述健康中華整樣品的基因組DNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并通過溫 度梯度來確定引物的最佳退火溫度，接著在8%非變性聚丙締酷胺凝膠電泳后進(jìn)行邸染色 (漠化乙錠染色法），凝膠成像系統(tǒng)拍攝電泳圖后讀帶，從而篩選出具有多態(tài)性的引物。
[0041] 本發(fā)明人通過轉(zhuǎn)錄測測序發(fā)現(xiàn)了包含SEQIDNO: 1所示的微衛(wèi)星序列和位點(diǎn)一一 然后對該位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計一一篩選出多態(tài)性引物一一分析引物在抗菌群體和易感群體 中的表達(dá)一一篩選出兩個群體中有差異的等位基因位點(diǎn)一一最終確定目標(biāo)微衛(wèi)星序列位 點(diǎn)及特異性等位基因，其中，引物序列如表1。
[0042] 表1對嗜水氣單胞菌易感型中華整微衛(wèi)星引物
[0043]
[0044] 實(shí)施例3對中華整微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增
[0045] 用W下條件對易感組和抗嗜水氣單胞菌組的DM進(jìn)行擴(kuò)增：具體見表2和表3
[0046] 表2PCR擴(kuò)增體系
[0047]
W48] 表3PCR擴(kuò)增條件
[0049]
[0050] 實(shí)施例4對中華整微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行檢測
[0051] 根據(jù)制膠材料的不同，常用的電泳可分為瓊脂糖凝膠電泳和聚丙締酷胺凝膠電 泳。前者比后者的分辨能力低，但分離范圍廣，可分離2(K)bp-50化的DNA。非變性聚丙締酷 胺凝膠一般用于分離5-5(K)bp的小片段，可分離相差1bp的DNA片段，但制備過程較為復(fù) 雜。PCR擴(kuò)增之后的產(chǎn)物，首先用1.5%瓊脂糖凝膠檢測，如果擴(kuò)增效果好的再采用非變性 聚丙締酷胺凝膠檢測，并進(jìn)行銀染。具體步驟如下：
[0052] (1)稱取Ig瓊脂糖粉末，在電爐上用lOOmL蒸饋水溶解至特明狀。
[005引 似組裝好制膠器，并調(diào)至水平。待溶液冷卻到60°C時（放于掌心能感覺到燙但 又能忍受），將膠倒于制膠器中，插好梳子。40min膠冷卻凝固后，就可放于倒好電泳緩沖液 的電泳槽中進(jìn)行點(diǎn)樣。
[0054] 做取2μL樣品溶液，加1yL6Xloadingbuffer,混合均勻后進(jìn)行點(diǎn)樣。每排點(diǎn) 樣孔要點(diǎn)一個3μL的Marker。 陽化引 （4)點(diǎn)完后，調(diào)整電泳儀各參數(shù)進(jìn)行電泳：U:120V;A:100mA;Τ:40min。
[0056] (5)電泳結(jié)束，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。
[0057] 非變性聚丙締酷胺凝膠步驟如下：
[0058] (1)用自來水洗干凈制膠用的玻璃板并用蒸饋水沖洗最后用無水乙醇擦一遍。烘 干后，用橡膠繩封閉玻璃板間的縫隙，并用夾子夾住。
[0059] 似在100血小燒杯內(nèi)加入12 %丙締酷胺35血，10%APS467μL，TEMED 23. 3μ以用玻璃棒攬勻，立即灌膠（從一側(cè)緩緩地加入），插入梳子，梳齒下不得存有氣泡， 膠板與桌面夾角小于10°。放置，常溫聚合30~60min。 W60] 做凝膠聚合后向電泳槽加入1XTBE，用注射器排除點(diǎn)樣孔中的氣泡，并弄出點(diǎn) 樣孔中的堵塞的膠，160V預(yù)電泳lOmin，準(zhǔn)備上樣。
[0061] (4)取1μL上樣buffer與2μLPCR產(chǎn)物于干凈的陽手套，用移液槍反復(fù)吹打 3-4次，W便充分混合均勻，用移液槍上樣。 陽06引 妨接160V電壓，根據(jù)漠酪藍(lán)指示劑的位置，確定電泳時間。一般電泳化。
[006引 （6)電泳結(jié)束小屯、的取下玻璃板，在玻璃板左右邊劃一下，小屯、取下膠。將膠放在 蒸饋水中沖洗一下。
[0064] (7)往白瓷盤中加入500血染色液，搖床上80轉(zhuǎn)/min輕搖lOmin。將染色液倒回 瓶中（可重復(fù)使用2-3次）。 W65] 做小屯、地取出膠，在蒸饋水中沖洗一下，再放在顯影液中，80轉(zhuǎn)/min顯影3min。
[0066] (9)拿出膠放在蒸饋水中終止反應(yīng)。
[0067] (10)把顯影好的膠放在凝膠成像系統(tǒng)中拍照，保存圖片。
[0068] 實(shí)施例5對嗜水氣單胞菌易感的相關(guān)微衛(wèi)星位點(diǎn)的篩選及統(tǒng)計分析
[0069] 等位基因頻率指一個群體中某一基因?qū)ζ涞任换虻南鄬Ρ嚷?。由于微衛(wèi)星呈共 顯性遺傳，所W對測得的基因型進(jìn)行統(tǒng)計計算即可獲得等位基因頻率，通過獲得等位基因 后計算等位基因的頻率，再比較等位基因頻率在中華整中的分布差異。
[0070] 其中，每一個微衛(wèi)星引物都事先檢測46個樣品，其中抗嗜水氣單胞菌組和易感組 各一半，分析基因頻率在兩組間是否顯著。對于存在顯著差異的微衛(wèi)星位點(diǎn)再進(jìn)行擴(kuò)大規(guī) 模檢測。對于有疑問的位點(diǎn)，則電泳進(jìn)行再次驗(yàn)證。檢測完一個位點(diǎn)后，把該位點(diǎn)所有的等 位基因（不同長度的片段）在同一塊凝膠上電泳，統(tǒng)計該微衛(wèi)星序列位點(diǎn)上各等位基因的 頻率。
[0071] 具體結(jié)果如下表所示：
[0072] 表4對嗜水氣單胞菌易感的中華整微衛(wèi)星序列等位基因頻率統(tǒng)計分析
[0073]
[0074] 表4的結(jié)果表明，該微衛(wèi)星序列位點(diǎn)在群體中至少存在四個等位基因，分別是 11%口、1436口、16化口、17%口，其中17抓口處等位基因僅在易感組中出現(xiàn)，具有特異性地表 達(dá)。據(jù)統(tǒng)計，在中華整對嗜水氣單胞菌易感群體中，179bp等位基因的基因頻率為25. 83%。
【主權(quán)項】
1. 一種對嗜水氣單胞菌易感性相關(guān)的中華鱉微衛(wèi)星序列，其特征在于：核苷酸序列如 SEQIDNO. 1 所示。2. -種根據(jù)權(quán)利要求1所述的對嗜水氣單胞菌易感性相關(guān)的中華鱉微衛(wèi)星序列設(shè)計 的微衛(wèi)星引物對，其特征在于：其序列分別為SEQIDNO. 2和SEQIDNO. 3,其中 上游引物的核苷酸序列SEQIDN0.2為：F:CCATGGTCAGGTCTCTGCTC; 下游引物的核苷酸序列SEQIDNO. 3為：R:CTCCTGGTACCCCCAAAACC。3. -種根據(jù)權(quán)利要求1所述的對嗜水氣單胞菌易感性相關(guān)的中華鱉微衛(wèi)星序列在篩 選對嗜水氣單胞菌易感型中華鱉中的應(yīng)用。4. 一種根據(jù)權(quán)利要求2所述的引物對在篩選嗜水氣單胞菌易感型中華鱉個體中的應(yīng) 用。5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的應(yīng)用，該應(yīng)用不用于疾病的診斷和治療，其應(yīng)用步驟為： 1) 基因組DNA的提?。菏褂没蚪MDNA提取試劑盒從中華鱉群體中分別提取基因組 DNA作為擴(kuò)增的模板； 2) 微衛(wèi)星PCR擴(kuò)增：利用該微衛(wèi)星引物對對基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 3) 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳：采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳法及銀染法檢測微衛(wèi)星擴(kuò)增產(chǎn)物； 4) 檢測：通過檢測不同個體中微衛(wèi)星位點(diǎn)的電泳結(jié)果進(jìn)行多態(tài)性分析，中華鱉群體中 至少存在四個等位基因，分別是119bp、143bp、161bp和179bp，其中179bp處等位基因在中 華鱉易感嗜水氣單胞菌群體中表達(dá)具有特異性，該微衛(wèi)星位點(diǎn)可作為篩選嗜水氣單胞菌易 感中華鱉個體的分子標(biāo)記。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種對嗜水氣單胞菌易感性相關(guān)的中華鱉微衛(wèi)星序列及其應(yīng)用，其核苷酸序列分別為SEQ？ID？NO.1，引物序列為SEQ？ID？NO.2和SEQ？ID？NO.3，本發(fā)明開發(fā)出了一種適用于嗜水氣單胞菌易感型個體篩選的中華鱉微衛(wèi)星序列及引物，本發(fā)明人還基于微衛(wèi)星的核酸序列設(shè)計了特異性的引物，且本發(fā)明發(fā)現(xiàn)該微衛(wèi)星序列分子標(biāo)記和嗜水氣單胞菌易感性相關(guān)，通過基因型分析的方式可篩選出對嗜水氣單胞菌易感中華鱉個體，本發(fā)明篩選出的1個微衛(wèi)星位點(diǎn)具有高度多態(tài)性和穩(wěn)定性，可進(jìn)一步應(yīng)用于中華鱉分子輔助育種。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN105331705
【申請?zhí)枴緾N201510791962
【發(fā)明人】王偉, 錢國英, 李彩燕, 尹尚軍, 葛楚天, 徐建, 陳忠法, 汪財生
【申請人】浙江萬里學(xué)院
【公開日】2016年2月17日
【申請日】2015年11月17日