檢測(cè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)真菌性感染者腦脊液中病原菌的基因芯片及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是多位點(diǎn)基因檢測(cè)忍片，尤其是適用于 中樞神經(jīng)系統(tǒng)真菌性感染者腦脊液中病原菌的快速診斷的集成檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 中樞神經(jīng)系統(tǒng)（centralnervoussystem,CN巧感染是神經(jīng)系統(tǒng)主要疾病譜之一， 臨床多表現(xiàn)為腦膜（腦）炎癥狀，如發(fā)熱、頭痛、嘔吐、意識(shí)障礙及腦膜刺激征等，病死率和 致殘率高，早期明確的病原學(xué)診斷是臨床正確抗感染治療的關(guān)鍵。真菌性病原體是引起CNS 感染的眾多病原微生物中較常見之一。長(zhǎng)期W來(lái)，臨床微生物實(shí)驗(yàn)室用于診斷真菌性CNS 感染病原體的方法主要包括腦脊液涂片鏡檢與培養(yǎng)鑒定等表型方法、腦脊液免疫學(xué)檢測(cè)方 法及基于聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)的各種技術(shù)（如RT-PCR，多重PCR，巧光定量PCR等），鮮有利 用真菌18/28SrRNA基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)構(gòu)建基因忍片來(lái)鑒定病原體的報(bào)道。
[0003] 腦脊液涂片鏡檢和培養(yǎng)等表型方法目前仍是各臨床實(shí)驗(yàn)室診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)感 染最常用的檢測(cè)手段，從中發(fā)現(xiàn)致病菌是判斷感染的"金標(biāo)準(zhǔn)"，但運(yùn)些常規(guī)方法存在如下 不足：（1)由于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法學(xué)原因?qū)е赂腥静≡w無(wú)法檢測(cè)或檢測(cè)周期過(guò)長(zhǎng)，滯后于 臨床需求使確診困難而錯(cuò)失早期或關(guān)鍵期的治療機(jī)遇：①腦脊液涂片顯微鏡檢查，檢出率 低，敏感性差；②腦脊液真菌培養(yǎng)所需時(shí)間長(zhǎng)（4-7天）、培養(yǎng)陽(yáng)性率低（約10-15%左右）； ③受抗生素使用等因素影響、無(wú)法實(shí)現(xiàn)廣譜病原體的篩查和監(jiān)測(cè)。（2)由于病原體無(wú)法或快 速準(zhǔn)確的分離鑒定，導(dǎo)致治療的盲目性，使耐藥菌增加并加重患者負(fù)擔(dān)：①目前使用的全自 動(dòng)真菌鑒定儀在鑒定某些菌時(shí)可能出現(xiàn)差錯(cuò)，鑒定準(zhǔn)確性值得商権；②商品化表型鑒定系 統(tǒng)數(shù)據(jù)庫(kù)有限，很難區(qū)分表型相近病原菌；③質(zhì)譜鑒定儀鑒定目前仍需先獲得陽(yáng)性菌落，直 接檢測(cè)鑒定真菌病原體仍需大量樣本來(lái)驗(yàn)證。
[0004] 腦脊液免疫學(xué)檢測(cè)方法（如隱球菌乳膠凝集檢測(cè)）只能檢測(cè)特定病原體，不能檢 測(cè)腦脊液中未知真菌和對(duì)病原菌進(jìn)行分類，存在假陽(yáng)性率高等缺點(diǎn)。PCR檢測(cè)方法主要采用 巧光定量PCR技術(shù)和脫氧核糖核酸測(cè)序技術(shù)，目前運(yùn)些技術(shù)只能針對(duì)單個(gè)真菌核酸進(jìn)行檢 巧。，通量低；脫氧核糖核酸測(cè)序技術(shù)操作復(fù)雜，不便于在檢驗(yàn)科實(shí)驗(yàn)室常規(guī)開展，其結(jié)果的 判定亦存在一定錯(cuò)誤的風(fēng)險(xiǎn)，需多拷貝雙向測(cè)序。而目前眾多基因忍片多W硝酸纖維膜和 尼龍膜等不同載體和地高辛、膠體金顯色等方法制備，雖有基于真菌leSrRNA微型寡合巧 酸忍片檢測(cè)腦脊液病原菌的研究，但存在致病菌覆蓋不全面、缺少大樣本臨床驗(yàn)證數(shù)據(jù)等 不足，鮮有真菌病原體診斷性忍片的報(bào)道。
[0005] 目前臨床微生物實(shí)驗(yàn)室采用的傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定存在諸多客觀缺點(diǎn)，如依靠表型鑒 定、敏感性低、檢測(cè)周期長(zhǎng)、易受抗生素應(yīng)用等各方面的限制，鑒定準(zhǔn)確性亦值得商権，不能 滿足臨床快速診斷的要求。目前進(jìn)行菌種分型的方法主要有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段 長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP)、測(cè)序、序列特異性引物PCR、巧光定量PCR等方法，不僅操作繁瑣、 檢測(cè)周期長(zhǎng)、通量小，且檢測(cè)過(guò)程影響因素多、不易控制，不能同時(shí)對(duì)多種病原體進(jìn)行分型， 難w滿足臨床檢驗(yàn)的要求，使臨床至今無(wú)法開展中樞神經(jīng)感染真菌病原體的廣譜、集成檢 測(cè)。
[0006] 基因忍片是近幾年在高科技領(lǐng)域內(nèi)出現(xiàn)的最具時(shí)代特征的重大科技進(jìn)展之一，其 主要原理是將能反映樣本中大量基因信息的基因探針（寡核巧酸探針、cDNA克隆、PCR產(chǎn)物 等）W-定順序和密度固定在載體（如載玻片或娃片、尼龍膜、硝酸纖維素膜、塑料片等） 上形成陣列，與實(shí)際樣本（或核酸擴(kuò)增產(chǎn)物）進(jìn)行雜交反應(yīng)，通過(guò)雜交信號(hào)分析可高通量獲 得所有待檢基因的信息。該技術(shù)W其高通量、快速、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)為感染病原學(xué)診斷提供 了一條新的解決途徑，對(duì)患者感染性疾病的臨床治療、預(yù)后評(píng)估具有重要作用。
[0007] 真菌核糖體RNA(rRNA)包括5S、5. 8S、18S、28SrRNA，W多拷貝形式存在于所有真 核染色體基因中。國(guó)內(nèi)外有利用真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（InternalTranscribedSpacer, 口巧 基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)用于真菌鑒定的報(bào)道。但未見有基于真菌rRNA的忍片技術(shù)用于臨床檢測(cè)腦 脊液真菌的研究。目前市場(chǎng)上最主要的基因忍片產(chǎn)品是W點(diǎn)樣等方法制備的用于基因表達(dá) 檢測(cè)的中、低密度基因忍片。基因忍片的一個(gè)重要發(fā)展趨勢(shì)是忍片制備、樣品處理、雜交、檢 測(cè)W及數(shù)據(jù)分析的標(biāo)準(zhǔn)化，提高基因忍片的準(zhǔn)確性和可靠性。因此，如何即保證檢測(cè)高通 量，又保證忍片性能優(yōu)越性是其的瓶頸問題之一。而利用基于真菌28SrRNA基因的多位點(diǎn) 忍片檢測(cè)多種中樞神經(jīng)感染真菌病原體，發(fā)揮其操作簡(jiǎn)單、通量大、結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn)，對(duì)于 臨床分析中樞神經(jīng)感染真菌病原體及種類具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于克服上述不足，提供一種檢測(cè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)真菌性感染者腦脊 液中病原菌的基因忍片及試劑盒，利用基于真菌28SrRNA基因的多位點(diǎn)忍片檢測(cè)多種中樞 神經(jīng)感染真菌病原體的問題。
[0009] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)真菌性感染者腦脊液中病原菌 的基因忍片，包括固相載體和固定在該固相載體上的寡核巧酸探針，其特征在于：所述寡 核巧酸探針包括在基質(zhì)上設(shè)置的真菌28SrRNA通用探針和鑒定真菌的種特異性探針，所 述鑒定真菌的種特異性探針為SEQIDN0:l-N0:4所示的堿基序列的DNA片段，所述真菌 28SrRNA通用探針為SEQID^:5所示的堿基序列的0臟片段。
[0010] 進(jìn)一步地，上述鑒定真菌的種特異性探針5'端含有氨基修飾的聚dT串，所述氨基 修飾的聚dT串為16聚的聚脫氧胸巧酸。
[0011] 進(jìn)一步地，該基因忍片還包括SEQIDNO:6所示的標(biāo)記有生物素點(diǎn)的DNA序列。
[0012] 進(jìn)一步地，所述固相載體為修飾玻片或娃片。
[0013] 本發(fā)明的另一目的還在于提供一種用于檢測(cè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)真菌性感染者腦脊液 中病原菌的試劑盒，其特征在于包括如權(quán)利要求1所述基因忍片。
[0014] 進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括SEQIDNO:7-N0 :8所示的引物序列。
[0015] 進(jìn)一步地，所述引物的5'端帶有標(biāo)記基團(tuán)，所述標(biāo)記基團(tuán)包括：地高辛分子、生物 素分子、巧光素及其衍生物分子、切3,切5、堿性憐酸酶、辣根過(guò)氧化物酶。
[0016] 本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)真菌性感染者腦脊液中病原菌的方法，不 用于疾病的診斷和治療，其特征在于：包括如下步驟：
[0017] (1)用常規(guī)方法制備模板DNA;
[001引 似用權(quán)利要求6所述引物序列將步驟（1)中制備的模板DM通過(guò)PCR反應(yīng)進(jìn)行 擴(kuò)增，獲得5'端帶有標(biāo)記基團(tuán)DNA擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0019] (3)將步驟（2)中DNA擴(kuò)增產(chǎn)物與雜交緩沖液混合；
[0020] (4)將步驟（3)中所得混合液與權(quán)利要求3所述的基因忍片上面分布的DNA探針、 Bio進(jìn)行雜交反應(yīng)；
[0021] (5)完成步驟（4)雜交反應(yīng)后，檢測(cè)基因忍片的雜交信號(hào)，根據(jù)標(biāo)記信號(hào)在基因忍 片上的位置、強(qiáng)度等信息獲取待測(cè)信息。
[0022] 進(jìn)一步地，在所述步驟（4)前先將基因忍片與預(yù)雜交緩沖液進(jìn)行預(yù)雜交。
[002引進(jìn)一步地，所述步驟似中PCR反應(yīng)的步驟，還包括：
[0024] 1)94°C預(yù)變性 5 分鐘；2)94°C變性 45s;3)58°C退火 45s;4)72°C延伸 60s，重復(fù) 2)-4) 30次；5)最后72°C延伸7min的反應(yīng)步驟。
[00巧]本發(fā)明適用于從腦脊液等臨床標(biāo)本中直接提取病原菌DNA用于PCR擴(kuò)增，祀基因 用于雜交檢測(cè)，可用于疑似真菌性感染的病原體篩查。本發(fā)明W固體材料載體為基質(zhì)，便于 生產(chǎn)和操作；用真菌通用引物PCR方法擴(kuò)增祀基因，避免了費(fèi)時(shí)的培養(yǎng)階段，大大縮短了檢 測(cè)時(shí)間（約4小時(shí)左右）；利用標(biāo)記的祀序列和基質(zhì)上的寡核巧酸探針進(jìn)行雜交的鑒定方 法較基于生理和生化的鑒定方法更準(zhǔn)確，增加了檢測(cè)準(zhǔn)確度，且不受培養(yǎng)條件和真菌生理 狀態(tài)的影響；無(wú)論菌"死活"，基因忍片檢測(cè)結(jié)果均提供重要臨床價(jià)值。該技術(shù)方法不僅能在 較短的時(shí)間明確真菌的存在與否，還可判讀臨床常見感染性疾病病原菌，