檢測(cè)pd致病基因突變的方法，及其引物、試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及檢測(cè)PD致病基因突變的方法，及其引物、試 劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] PD(Parkinson'sdisease)基因，大量研究證明GBA和LRRK2基因突變可能增加患 帕金森病的危險(xiǎn)性，且在人群中的分布具有明顯的種族差異性。GBA基因突變對(duì)PD發(fā)病潛 在影響的研究已成為目前PD研究的熱點(diǎn)。中國(guó)人群中最常見(jiàn)的GBA基因突變則是L444P， 約占36%。LRRK2(富含亮氨酸重復(fù)序列激酶2)基因變異不僅能夠?qū)е峦戆l(fā)性家族型帕 金森病的發(fā)生，而且與散發(fā)型帕金森病也存在顯著相關(guān)，為常染色體顯性遺傳性PD致病基 因。其變異具有種族的特異性，在LRRK2基因多態(tài)性中，G2385R和R1628P是二個(gè)東亞人群 的特異性位點(diǎn)，未出現(xiàn)于其他種族。
[0003] 現(xiàn)有的檢測(cè)技術(shù)主要是基于單個(gè)突變位點(diǎn)的PCR和測(cè)序方法及單基因忍片方法， 缺點(diǎn)主要在于僅僅能檢測(cè)單個(gè)突變位點(diǎn)，不能對(duì)多個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，也不能對(duì)分 布于多個(gè)外顯子的位點(diǎn)進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服上述不足，提供一種檢測(cè)PD致病基因突變的方法，其解決 了現(xiàn)有技術(shù)中進(jìn)行PD致病基因突變檢測(cè)程序繁瑣、費(fèi)用昂貴、費(fèi)時(shí)、易污染和靈敏度低等 問(wèn)題。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種檢測(cè)PD致病基因突變的方 法，不用于疾病的診斷和治療，其特征在于，其包括如下實(shí)現(xiàn)步驟：
[0006] 樣本處理：取外周血2ml于邸TA抗凝管中，輕柔地顛倒混勻，4°C保存；
[0007]DNA提取，取200μL抗凝血用試劑盒提取DNA，包括：
[000引 1)加 200μ1BufferBL，震蕩混合，于70°C解育10分鐘；
[0009] 2)加200μ1無(wú)水乙醇震蕩混合約20秒；
[0010] 3) 12000巧m離屯、1 分鐘；
[0011] 4)取上清轉(zhuǎn)入收集柱中，1200化pm離屯、2分鐘；
[0012] 5)將收集柱置一個(gè)新的收集管上，加入500μ1皿solution,室溫放置5分鐘； [001引 6) 12000巧m離屯、2分鐘；
[0014] 7)加入 700μIwashBuffer, 12000巧m離屯、2 分鐘；
[0015] 8)將收集柱置一個(gè)新的收集管上，加入700μ1washBuffer, 12000巧m離屯、2分 鐘；
[0016] 9)棄收集管內(nèi)液體，12000;rpm離屯、2min;
[0017] 10)將收集柱放入一個(gè)新的1. 5ml離屯、管內(nèi)，加入50μ1 70°C預(yù)熱的洗脫液，室 溫放置l-2min，12000巧m離屯、2分鐘，濾液即為模板DNA;
[001引PCR擴(kuò)增
[001引 PCR反應(yīng)體系：
[0020] 10XPCRBuffer2. 5μ1 ；
[0021] HotStarTaqDMPolymerase按kit標(biāo)準(zhǔn)調(diào)整；
[0022] dNTPmix2μ1 ；
[002引上游引物PrimerU1μ1;
[0024]下游引物PrimerL1μ1 ;
[00巧]DM模板Xμ1 ;
[0026] 滅菌蒸饋水25μ1 ---上述總體積；
[0027] PCR產(chǎn)物電泳：1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果；
[0028] PCR產(chǎn)物純化
[0029] 每管內(nèi)加入100μ1PCR-A液，混勻，轉(zhuǎn)入純化柱內(nèi)，12000巧m離屯、2min;
[0030]棄收集管內(nèi)液體，加入 700μ1washingbuffer, 12000巧m離屯、2min;
[0031]棄收集管內(nèi)液體，加入 400μ1washingbuffer, 12000巧m離屯、2min;
[003引棄收集管內(nèi)液體，12000巧m離屯、2min;
[003引柱內(nèi)加入30μ1 70 °C預(yù)熱洗脫液，12000巧m離屯、3min;
[0034] 測(cè)序反應(yīng)
[0035]反應(yīng)體系：0. 8μ1Bi曲ye+1. 5μ1Bi曲yeSeqBuffer+3μ1引物+1μ1PCR純 化產(chǎn)物+3. 5μ1dd&0;
[0036] 測(cè)序PCR熱循環(huán)條件：
[0037] 1)變性的條件，96°ClOsec;
[0038] 5)退火的條件，（首先96°ClOsec，其次50°C5sec，然后60°C4min)X25個(gè)循環(huán)；
[0039] 6)延伸的條件，60°C4min;
[0040] 7)4°C保溫；
[0041] 每一步的時(shí)間應(yīng)從反應(yīng)混合液達(dá)到所要求的溫度后開(kāi)始計(jì)算；
[0042] 測(cè)序產(chǎn)物純化
[0043]lOul反應(yīng)體系，96孔板，酒精/EDTA/NaAc法；
[0044]1)每管加入100μ1 100%酒精，或每管加入1μ1 125mM邸TA到管底，或每管加 入1μ1 3MNaAc到管底，然后震蕩混勻，室溫放置15min;
[0045]2) 10°C，4000巧m離屯、30min，馬上倒置，1200巧m離屯、Imin;
[004引 3)每管加入100μΙ70%酒精，離屯、15min;5°C，3600巧m離屯、30min，馬上倒置， 1200巧m離屯、Imin;
[0047] 4)室溫?fù)]發(fā)凈酒精，加入10μ1Hi-Di化rmamide溶解DM;
[004引 W95°C變性5min，4°C保溫4min，加樣上機(jī)；
[0049] 6)測(cè)序純化：ABIBigdyeXTerminatorpurificationkit;
[0050]PCR檢測(cè)，包括：
[0051] 1)對(duì)照孔的設(shè)立和檢測(cè)重復(fù)孔：樣本檢測(cè)同時(shí)設(shè)有對(duì)照實(shí)驗(yàn)，包括陰性對(duì)照；對(duì) 照和樣本均采用復(fù)孔；
[0052] 在PD基因突變位點(diǎn)兩端設(shè)計(jì)Ξ對(duì)特異性引物；
[0053] 所述引物GBA-F的核巧酸序列為：
[0054] 5' -AATTGGGTGCGTAACTTTGTC-3',
[005引所述引物GBA-R的核巧酸序列為：
[0056] 5' -ACTTCCCAGACCTCACCATTG-3',
[0057] 所述LR服2-F1引物的核巧酸序列為：
[0058] 5' -TTGCTAAGCAAAATAGCCCTG-3'，
[0059] 所述LR服2-R1引物的核巧酸序列：
[0060] 5' -AAGATGGTGCTGAGAAGCATTAC-3'；
[0061] 所述LR服2-F2引物的核巧酸序列為：
[0062] 5' -AGATTTTGACAGTGAAAGTGGAAG-3',
[0063] 所述LR服2-R2引物的核巧酸序列：
[0064]日'-TAAGGTTTTCTTTACCTGCTTGG-3';
[0065] 所述引物PCR擴(kuò)增出目的片段模板；
[006引所述目的片段的獲取包括：W上述引物分別對(duì)人基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到條 帶單一的目的基因片段；將目的片段稀釋至1萬(wàn)-10萬(wàn)倍，終濃度為10-2化g/μL作為檢 測(cè)陰性對(duì)照用；
[0067] 。25 μ L反應(yīng)體系檢測(cè)：
[0068] 2XPowerTaqPC艮Mastei'MixterMIXl;erM悅 終濃度！χ DNA模板 l-lOng/μΙ Phmei.U 終濃度為400ηΜ PrimerL 終濃度為400nM 滅茵蒸傭水 υρ?ο25μ1
[0069] 混合均勻；所有樣本混合完后，將ΑΒΙ Veriti Dx PCR系統(tǒng)儀器中進(jìn)行程序性檢 測(cè)；
[0070] 結(jié)果分析及判定：對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析。
[0071] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種檢測(cè)PD致病基因突變的引物，其特征在于，所述 引物序列包括：
[0072]沈Q ID N0:15'-AATTGGGTGCGTAACTTTGTC-3'
[0073]沈Q ID N0:25'-ACTTCCCAGACCTCACCATTG-3'
[0074]沈Q ID N0:35'-TTGCTAAGCAAAATAGCCCTG-3'
[00巧]沈Q ID N0:45，-AAGATGGTGCTGAGAAGCATTAC-3，
[0076] SEQ ID N0:55'-AGATTTTGACAGTGAAAGTGGAAG-3'
[0077]沈Q ID N0:65'-TAAGGTTTTCTTTACCTGCTTGG-3'。
[0078] 本發(fā)明的還一目的在于提供一種包括所述引物的檢測(cè)PD致病基因突變的試劑 盒。
[0079] 本發(fā)明的有益效果為：
[0080] 能對(duì)多個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，也能對(duì)分布于多個(gè)外顯子的位點(diǎn)進(jìn)行同時(shí)檢 ，簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、有效的對(duì)強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良兩種突變類型進(jìn)行檢測(cè)和臨床診斷，利用 多種特異性引物同時(shí)對(duì)患者可能存在的多個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，使用該方法能保證95%W 上的疾病檢出率。其解決了現(xiàn)有技術(shù)中進(jìn)行PD致病基因突變檢測(cè)程序繁瑣、費(fèi)用昂貴、費(fèi) 時(shí)、易污染和靈敏度低等問(wèn)題，尤其是提供了病理組織之外的非創(chuàng)傷性如血清或血漿等檢 測(cè)。
【附圖說(shuō)明】
[0081] 此處所說(shuō)明的附圖用來(lái)提供對(duì)本申請(qǐng)的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本申請(qǐng)的一部分，本申 請(qǐng)的示意性實(shí)施例及其說(shuō)明用于解釋本申請(qǐng)，并不構(gòu)成對(duì)本申請(qǐng)的不當(dāng)限定。在附圖中：
[0082] 圖1是本發(fā)明PD致病基因檢測(cè)分析結(jié)果示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0083]W下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)上述方案做進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，運(yùn)些實(shí)施例是用于說(shuō)明 本發(fā)明而不限于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中采用的實(shí)施條件可W根據(jù)具體廠家的條件做 進(jìn)一步調(diào)整，未注明的實(shí)施條件通常為常規(guī)實(shí)驗(yàn)中的條件。
[0084] 實(shí)施例1
[0085] 樣本處理：取外周血2ml于邸TA抗凝管中，輕柔地顛倒混勻，4°C保存；
[0086]DNA提取，取200μ1抗凝血用試劑盒提取DNA，包括：
[0087] 1)加200μ1BufferBL，震蕩混合，于70°C解育10分鐘；
[008引。加 200μ1無(wú)水乙醇震蕩混合約20秒；
[0089] 3) 12000巧m離屯、1 分鐘；
[0090] 4)取上清轉(zhuǎn)入收集柱中，12000巧m離屯、2分鐘；
[0091] 5)將收集柱置一個(gè)新的收集管上，加入500 μ 1皿solution,室溫放置5分鐘；
[0092] 6) 12000巧m離屯、2 分鐘；
[0093] 7)加入 700μ1wash Buffer,12000巧m離屯、2 分鐘；
[0094]8)將收集柱置一個(gè)新的收集管上，加入700μ1wash Buffer,12000巧m離屯、2分 鐘；
[009引9)棄收集管內(nèi)液體，12000巧m離屯、2min;
[0096] 10)將收集柱放入一個(gè)新的1. 5ml離屯、管內(nèi)，加入50μ1 70°C預(yù)熱的洗脫液，室 溫放置l-2min，12000巧m離屯、2分鐘，濾液即為模板DNA;
[0097]PCR擴(kuò)增
[009引 PCR反應(yīng)體系：
[0099]10XPCR Buffer2.5μ1；
[0100]HotStarTaqDNAPolymerase按kit標(biāo)準(zhǔn)調(diào)整；
[0101]dNTP mix2μ1；