一種鴨黃病毒核酸液相芯片的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設及一種鴨黃病毒核酸液相忍片的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 鴨黃病毒屬于黃病毒科、黃病毒屬、恩塔亞病毒群，和該群中的Tembusu病毒親緣 關(guān)系最近。該病毒引起的傳染病于2010年5月在浙江、江蘇、福建等地發(fā)生感染，主要引起 蛋鴨和種鴨產(chǎn)蛋量驟減，甚至停產(chǎn)，發(fā)病率達100%，死亡率約5%~10%。目前，華北、華 中、華南和西南等地均有該病發(fā)生的報道，流行區(qū)域幾乎遍及我國主要水禽產(chǎn)區(qū)。據(jù)國家水 禽產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系2010年11月份調(diào)查顯示，該病造成的經(jīng)濟損失已超過50億元。
[0003] 目前疫病病原檢測主要WPCR和免疫學方法為主，但其不能滿足出入境等高通量 檢疫的要求，且臨床中多種疫病的病原鑒別診斷要求快速、高靈敏的檢測技術(shù)。液相忍片技 術(shù)是一種被用于臨床診斷的新型生物忍片，由Luminex公司于1995年研發(fā)，該技術(shù)是一項 突破性的生物忍片分子檢測新技術(shù)，具有高通量、靈敏度高、重復性好、靈活性大的特點。液 相忍片技術(shù)已通過抑A批準，應用于醫(yī)學臨床的高通量檢測，它在各種應用中的檢測結(jié)果 與傳統(tǒng)的ELISA基本一致，但有著ELISA無法比擬的優(yōu)越性。本研究利用液相忍片技術(shù)建 立檢測鴨黃病毒核酸的方法，并評價了該檢測方法的敏感性和特異性，為馬病毒性動脈炎 的檢測提供了一種高通量、敏感、特異、快速、高效的方法。
[0004] 液相忍片技術(shù)是20世紀90年代中期發(fā)展起的一種集流式技術(shù)、巧光微球、激光、 數(shù)字信號處理和傳統(tǒng)化學技術(shù)為一體的新型生物分子高通量多重檢測技術(shù)。它既可進行免 疫學檢測也可進行核酸檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：提供一種鴨黃病毒核酸液相忍片檢測方法。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0007] 本發(fā)明提供的鴨黃病毒核酸液相忍片檢測方法，包括下列步驟：
[000引 （1)設計引物探針
[0009] (2) RT-PCR反應體系的建立
[0010] (3)液相忍片檢測體系的建立 W11] 所述的設計的引物探針序列如下：
[0012] Primer1 :DYF:5-AGAATCCAGATGCCCAACCA-3 ;
[0013] Primer2 :DYR:5-Biotin-CACAATCCTGCCTTCTGCTTTC-3 ; 陽014] Probe :DYProbe:5-N肥（C肥）12-TCATAATCCCAAGGCAAC-3 ;
[0015] RC-Probe :DY-RCProbe:5-Biotin-GTTGCCTTGGGATTATGA-3。
[0016] 所述的RT-PCR反應體系的建立包括下列步驟：
[0017] 采用RNA提取試劑盒進行RNA的提取；在0. 2血PCR反應管中，依次加入 10XRT-PCRbuffer，2. 5yL;dNTP(各 2. 5mmol/L)，2.ΟμΙ;10pmol/yL引物對，各 1μL; Inhibiter0. 5μL;AMVXL0. 5μL;AMVTaq巧U/μL)，0. 25μL;25mmol/LMgClz，5.ομL;RNA模板5. 0μL;加入雙蒸水7. 25μL;使反應體積達到25μL;
[0018]在PCR儀巧ppendo;rfMaster巧clerGradient)上進行RT-PCR擴增，優(yōu)化并確定 RT-PCR工作程序：50°C30min;94°C2min;然后 94°C30sec、58°C30sec、72°C30sec，30 個 循環(huán)；最后72°C延伸5min，4°C保溫；
[0019] 擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外凝膠圖像分析系統(tǒng)（AlphamagerTM2200) 上觀察、分析擴增產(chǎn)物。
[0020] 所述的液相忍片檢測體系的建立，包括下列步驟：
[0021] (1)寡核巧酸探針與微球共價偶聯(lián)
[0022]①將微球縱滿混合20s充分分散；取3X106個微球（7加1)，于1. 5ml離屯、管中 lOOOOg離屯、Imin，去上清；
[0023]②加入50ul0.Imol/L甲基咪挫溶液（pH4. 5)，縱滿混合，超聲波處理0. 5-lmin;
[0024]③加入氨基化探針1. Onmol，縱滿混合； 陽02引④加入2.加L碳二亞胺溶液（lOmg的碳二亞胺粉末加入1. 0血的滅菌純水，現(xiàn)用 現(xiàn)配）充分混勻，室溫避光解育30min;碳二亞胺溶液的配置方法是lOmg的碳二亞胺粉末 加入1.0血的滅菌純水； 陽0%] ⑥重復④一次；
[0027]⑧加入 1. 0ml0. 02%Tween-20,混勻，lOOOOg離屯、Imin，棄上清；
[0028]⑦加入 1. 0ml0. 1 %SDS，混勻，lOOOOg離屯、Imin，棄上清；
[0029] ⑨用0.1mol/L甲基咪挫溶液（ph4. 5)lOOuL重懸微球，2-8°C避光保存，待用；
[0030] 似雜交 陽〇3U 雜交體系包括1. 5uL探針偶聯(lián)微球，33uL1. 5XTMAC雜交液，14.加LTE，2.加L RT-PCR產(chǎn)物；混合均勻后于98°C變性lOmin，在選定溫度下解育15min，ISOOOg離屯、2min去上清；加入50uL用IXTMAC雜交液稀釋的陽標記的鏈親合素（1 :500) ,48-56下。C解育 10-15min，ISOOOg離屯、2min去上清；加入50uL1XTMAC雜交液，縱滿混合使微球重懸，上 機分析。
[0032] 本發(fā)明的檢測方法具有高通量、檢測靈敏度高、重復性好等優(yōu)點，結(jié)合RT-PCR技 術(shù)，通過穩(wěn)定性試驗、特異性試驗與靈敏度試驗，成功構(gòu)建了液相忍片技術(shù)檢測鴨病毒的檢 測平臺。
【附圖說明】
[0033] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細的說明。
[0034] 圖1鴨黃病毒RNA作為模板進行RT-PCR的電泳結(jié)果。
[0035] 圖2是探針偶聯(lián)的有效性驗證。
[0036]圖3液相忍片檢測結(jié)果.
【具體實施方式】 陽〇37] 實施例1
[0038] 本實施例提供一種鴨黃病毒核酸液相忍片的檢測方法
[0039] 用到的材料與方法
[0040] 毒株
[0041] 鴨黃病毒，由本實驗室保存。
[00創(chuàng)試劑與設備
[00創(chuàng)表面簇基化的巧光編碼微球、銷液購置于抓公司，TMAC temtrameih5d-amnKlnium chloride、Tris、SDS(10%solution)購置于美國Sigma公司，SPAE Str巧tavidin-R-phycoer}ftbin購于美國Prozyme公司，RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒 購于大連寶生物公司。主要設備包括：BD FACSArray液相忍片儀、梯度PCR擴增儀、凝膠成 像系統(tǒng)、Sigma高速冷凍離屯、機等。 W44] (1)引物探針的設計 W45] 引物、探針及其探針的反向互補序列如下表
[0046]
[0048] 注：5' -Biotin表示5'端進行生物素標記；5'-N肥表示5'端進行氨基化修飾。
[0049] (2) RT-PCR反應體系的建立
[0050] 采用RNA提取試劑盒（大連寶生物公司）進行RNA的提取。在0. 2血PCR反應 管中，依次加入 10XRT-PCRbuffer, 2. 5μL;dNTP(各 2. 5mmol/L)，2. 0μL;lOpmol/μL引 物對，各lyL;Inhibiter0. 5yL;AMVXL0. 5yL;AMVTaq巧U/yL)，0. 25yL;25mmol/ LMgClz，5. 0μL;RNA模板5. 0μL;加入雙蒸水7. 25μL;使反應體積達到25μL;在PCR儀 巧ppendo;rfMasteixyclerGradient)上進行RT-PCR擴增。優(yōu)化并確定RT-PCR工作程序： 50°C30min;94°C2min;然后 94°C30sec、58°C30sec、72°C30sec，30 個循環(huán)；最后 72°C延 伸5min，4°C保溫。
[0051] 擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外凝膠圖像分析系統(tǒng)（Alphamager?2200) 上觀察、分析擴增產(chǎn)物。產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電流分析，結(jié)果顯示擴增出大小為18化P左 右的目的條帶，與預期擴增的片段大小一致。電泳結(jié)果見圖1.
[0052] (3)液相忍片檢測體系的建立
[0053] 1.寡核巧酸探針與微球共價偶聯(lián)
[0054] ①將微球縱滿混合20s充分分散；取3X106個微球（7加1)，于1. 5ml離屯、管中 lOOOOg離屯、Imin，去上清； 陽05引②加入50ul0.Imol/L甲基咪挫溶液（ph4. 5)，縱滿混合，超聲波處理 (30s-imin)；
[0056] ③加入氨基化探針1.Onmol，縱滿混合；
[0057] ④加入2. 5uL碳二亞胺溶液（lOmg的碳二亞胺粉末加入1.0血的滅菌純水，現(xiàn)用 現(xiàn)配）充分混勻，室溫避光解育30min。
[0058] ⑨重復④一次。
[0059]⑩加入 1. 0ml0. 02%Tween-20,混勻，lOOOOg離屯、Imin，棄上清；
[0060] 敬加入 1. 0ml0. 1%