一組檢測(cè)鴨黃病毒的rt-lamp引物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一組檢測(cè)鴨黃病毒的RT-LAMP引物。
【背景技術(shù)】
[0002] 鴨黃病毒又名鴨坦布蘇病毒（DuckTembusuvirus)屬于黃病毒科 (Flaviviridae)，黃病毒屬（flavivirus)。2010年江浙滬一帶爆發(fā)了一種W蛋鴨產(chǎn)蛋率下 降、生長(zhǎng)遲緩、減重、食欲減退、高熱及部分死亡為癥狀的疾病，從病鴨體內(nèi)分離到了致病病 毒，經(jīng)過(guò)基因序列比對(duì)，該病毒被認(rèn)為是屬于一個(gè)新的基因型，為T(mén)MUV組的黃病毒屬的病 〇
[0003] 目前，鴨黃病毒檢測(cè)主要依賴(lài)病毒分離和分子生物學(xué)檢測(cè)。病毒分離是鴨黃病毒 的傳統(tǒng)檢測(cè)方法；分子生物學(xué)檢測(cè)方法有RT-PCR、套式RT-PCR、巧光定量RT-PCR等，運(yùn)些 方法操作繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是日本學(xué)者Notomi于2000年發(fā)明的一種 基因恒溫?cái)U(kuò)增新技術(shù)，其特點(diǎn)是針對(duì)祀基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)3對(duì)特異引物，利用一種鏈置換 DNA聚合酶在等溫條件化3 °C左右）保溫30-60分鐘，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。與常規(guī) PCR相比，該方法不需要電泳及紫外觀察等過(guò)程，且靈敏度、特異性都優(yōu)于PCR技術(shù)，而且不 需要任何專(zhuān)口的儀器設(shè)備即可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)高通量快速檢測(cè)，檢測(cè)成本低。本發(fā)明擬利用LAMP 技術(shù)，建立一種靈敏特異，快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)鴨黃病毒的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一組準(zhǔn)確性好、靈敏度高的檢測(cè)鴨黃病毒的 RT-LAMP引物。
[000引本發(fā)明提供的檢測(cè)鴨黃病毒的RT-LAMP引物，引物序列為： 上游內(nèi)引物FIP序列： 5' -GCGGCATGTTTCAGCGACTGCATGGTTCCACGGAAGCG-3'; 下游內(nèi)引物BIP序列： 5'-AACGCCCAAAAGTCCCGTCTACGGGGTTCACATTCGAGTGTG-3' ； 上游外引物F3序列： 5'-GCAGAAGGAAAACGTCCAGT-3' ； 下游外引物B3序列： 5'-CCCATGTCAACCCCAGATC-3' ； 上游環(huán)引物L(fēng)F序列： 5>-GGCTGAATAATTGTGGTAGGTGCT-3 ; 下游環(huán)引物L(fēng)B序列： 5'-ACCGCTGAGATGGAGGATTATG-3'。
[0006] 同時(shí)，本發(fā)明還提供一種試劑盒，包括W下組分： 1)RT-LAMP反應(yīng)液：內(nèi)含濃度為8mmol/LΜ拆04,5.6mmol/LdNTPMixUire; 2 )引物混合液；檢測(cè)鴨黃病毒的引物組按照F3:B3:FIP:BIP:LF:LB為5nM: 5nM: 40nM: 40nM: 20nM: 20nM的比例混合； 其中所設(shè)及的檢測(cè)引物序列為： 上游內(nèi)引物FIP序列： 5' -GCGGCATGTTTCAGCGACTGCATGGTTCCACGGAAGCG-3'， 下游內(nèi)引物BIP序列： 5'-AACGCCCAAAAGTCCCGTCTACGGGGTTCACATTCGAGTGTG-3'. 上游外引物F3序列： 5'-GCAGAAGGAAAACGTCCAGT-3' 下游外引物B3序列： 5'-CCCATGTCAACCCCAGATC-3'， 上游環(huán)引物L(fēng)F序列 5>-GGCTGAATAATTGTGGTAGGTGCT-3>， 下游環(huán)引物L(fēng)B序列 5'-ACCGCTGAGATGGAGGATTATG-3' 3) 酶混合物：濃度均為抓/μL的AMV反轉(zhuǎn)錄酶與8000U/mL的BstDNA聚合酶按1 :1 比例混勻分裝； 4) 目視巧光染料。
[0007] 5)DEPC水：內(nèi)含濃度為1%。的焦炭酸二乙醋。
[0008] 6)陰性對(duì)照：d地20。
[000引 7)陽(yáng)性對(duì)照：利用鴨黃病毒E基因構(gòu)建的假病毒顆粒。
[0010] 另外，利用上述試劑盒，本發(fā)明提供一種檢測(cè)方法，具體步驟是： 采集禽類(lèi)樣品后，將樣品和本試劑盒中的陽(yáng)性對(duì)照用常規(guī)試劑盒提取核酸RNA，從上述 試劑盒中取出RT-LAMP反應(yīng)液、酶混合物，引物混合液，DEPC水在室溫下融化后，200化/min 離屯、5s;每管測(cè)試反應(yīng)體系加入：RT-LAMP反應(yīng)液，7. 5μL;引物混合液，6μL;酶混合物， 2μL;目視巧光染料，1μL;DEPC水，3. 5μL;再分別加入處理后制備的陽(yáng)性對(duì)照和樣品的 RNA溶液及陰性對(duì)照各5μL蓋緊管蓋，于4000r/min離屯、5s;將PCR管排好，放入63°C水 浴鍋水浴1小時(shí)或是放入PCR儀運(yùn)行63°C保溫1小時(shí)。
[0011]反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行結(jié)果檢測(cè)，具體包括Ξ種： (一）RT-LAMP反應(yīng)的目視檢測(cè)方法： 陰性對(duì)照呈現(xiàn)淺橘黃色，陽(yáng)性對(duì)照呈巧光綠色，樣品根據(jù)反應(yīng)后管內(nèi)液體的顏色進(jìn)行 判斷陰性陽(yáng)性。
[001引仁）RT-LAMP反應(yīng)的濁度檢測(cè)方法 反應(yīng)結(jié)束后，將所有PCR管進(jìn)行離屯、1000化pm，Imin，觀察管底，陰性對(duì)照管底無(wú)沉淀， 陽(yáng)性對(duì)照有白色沉淀，樣品根據(jù)有無(wú)白色沉淀進(jìn)行判斷陰陽(yáng)性。
[0013] (Ξ)RT-LAMP反應(yīng)的凝膠電泳檢測(cè)方法 用含漠化乙錠（EB)的1.5%瓊脂糖凝膠電泳。在紫外透射儀下觀察核酸帶。陽(yáng)性對(duì) 照擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳后，可見(jiàn)從點(diǎn)樣孔的拖尾現(xiàn)象W及很多不同擴(kuò)增長(zhǎng)度的條帶，陰性對(duì) 照無(wú)條帶，樣品根據(jù)電泳后條帶有無(wú)進(jìn)行判斷陰陽(yáng)性。
[0014] 有效原則：陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照分別成立。
[0015] 本發(fā)明的有益效果為： 本發(fā)明的引物序列用在RT-LAMP上檢測(cè)鴨黃病毒，確性好、靈敏度，建立的檢測(cè)方法：1)快速：從樣品處理到出結(jié)果僅需2小時(shí)左右；2)在本發(fā)明中，篩選出最佳引物濃度組合， 克服了兩步法檢測(cè)鴨黃病毒的不足，實(shí)現(xiàn)了一步法RT-LAMP檢測(cè)鴨黃病毒的目的。3)靈敏： 使用該方法比傳統(tǒng)PCR方法靈敏度高10~100倍；4)特異：與常見(jiàn)禽類(lèi)其他病毒不發(fā)生交 叉反應(yīng)，該方法的特異性高于傳統(tǒng)PCR方法，大大杜絕了非特異性擴(kuò)增造成的假陽(yáng)性結(jié)果； 5)本發(fā)明提供了質(zhì)量?jī)?yōu)異的試劑及優(yōu)化的操作程序，因此操作簡(jiǎn)單，具有良好重復(fù)性。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1.RT-LAMP抑染料結(jié)果。1.陰性對(duì)照；2.陽(yáng)性對(duì)照。
[0017] 圖2.RT-LAMP瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。1.陽(yáng)性對(duì)照；2.陰性對(duì)照；M.DNA分子標(biāo) 準(zhǔn)DL2000。
[001引 圖3.RT-LAMP與RT-PCR靈敏度的比較。A.抑染料結(jié)果；B.RT-LAMP瓊脂糖凝 膠電泳結(jié)果；C.RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；M.DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000; 1-9. 10倍 梯度稀釋的病毒RNA(101-109)10,陰性對(duì)照。
[0019] 圖4.RT-LAMP檢測(cè)方法的特異性試驗(yàn)結(jié)果。A.瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；B.抑染料 結(jié)果M.DNA分子標(biāo)準(zhǔn)化2000 1.鴨黃病毒；2.禽流感冊(cè)N1亞型；3.鴨病毒性腸炎病毒；4、鴨病毒性肝炎病毒。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 實(shí)施例1.鴨黃病毒RT-LAMP檢測(cè)試劑盒 試劑盒的組成 1、RT-LAMP反應(yīng)液：內(nèi)含濃度為8mmol/LΜ拆04,5.6mmol/LdNTPMixUire; 2、 引物混合液；檢測(cè)鴨黃病毒的引物組按照F3:B3:FIP:BIP:LF:LB為5nM: 5nM: 40 nM: 40nM: 20nM: 20