Hla基因的多重dna分型方法和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[OOOU 本發(fā)明設(shè)及使用了高通量DM測序儀的HLA基因的超高分辨率多重DM分型方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 作為人的主要組織相容性復(fù)合體（MajorHistocompatibilityComplex;MHC) 的人白細胞抗原（HumanLeuko巧teAntigen;HLA)通過向Τ細胞呈遞來自病原體等外來 蛋白質(zhì)的膚W及來自自身蛋白質(zhì)的膚而密切參與免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)，作為主要的HLA，已知有 6種抗原。即是幾乎在所有細胞中表達的I類抗原（HLA-A，HLA-B，HLA-C)與主要在免疫系 統(tǒng)的細胞中表達的II類抗原（HLA-DR，HLA-DQ，HLA-DP)。
[0003]HLAI類抗原由表現(xiàn)高度多態(tài)性的α鏈和幾乎沒有多態(tài)性的β2-微球蛋白構(gòu)成， HLAII類抗原由存在高度多態(tài)的β鏈與多態(tài)性低的α鏈構(gòu)成。I類抗原的α鏈由HLA-A， HLA-B，HLA-C的各基因所編碼，II類抗原的β鏈由HLA-DRB1，HLA-DRB3/4/5,HLA-D地 1， HLA-DPB1基因所編碼，α鏈由HLA-DRA1，HLA-DQA1，HLA-DPA1基因所編碼。在基因水平上， 在HLAI類抗原中，編碼α鏈的基因的外顯子2和外顯子3顯示高度的多態(tài)性，在HLAII 類抗原中，編碼β鏈的基因的外顯子2顯示高度的多態(tài)性。
[0004] 編碼HLA的基因區(qū)域位于人第6染色體短臂化21. 3,從端粒側(cè)朝向著絲粒 偵U，WI類區(qū)域（HLA-A，HLA-B，HLA-C等)、III類區(qū)域、II類區(qū)域（HLA-DRA，HLA-DRB1， HLA-DRB3/4/5,HLA-DQA1，HLA-D地 1，HLA-DPA1，HLA-DPB1 等）的順序排列，許多基因W非常 高的密度編碼，它們與輸血、移植和各種疾病的關(guān)聯(lián)性已被報道。在III類區(qū)域中不存在 HLA基因，而存在補體成分、腫瘤壞死因子（Tumor化crosis化ctorJNF)等的基因。 陽0化]在編碼HLA-DR抗原的β鏈的HLA-DRB基因區(qū)域中，確認了5種結(jié)構(gòu)多態(tài)性。在DR1型、DR10型中，除了HLA-DRB1之外，HLA-DRB6、HLA-DRB9等假基因也位于同一單元型 (haplotype)上。在DR2型中，除了HLA-DRB1之外，HLA-DRB5 (DR51)基因、HLA-DRB6、 HLA-DRB9等假基因也位于同一單元型上。在DR3、DR5和DR6型中，除了HLA-DRB1之外， HLA-DRB3 (DR52)基因、HLA-DRB2、HLA-DRB9等假基因也位于同一單元型上。在DR4、DR7和 DR9型中，除了HLA-DRB1之外，HLA-DRB4 (DR53)基因、HLA-DRB7、HLA-DRB8、HLA-DRB9等假 基因也位于同一單元型上。與它們相對，在DR8型中，HLA-DRB1 W外的HLA-DRB基因并不 位于同一單元型上（圖1)。
[0006] 各HLA基因的外顯子中，存在多個多態(tài)性豐富的區(qū)域(多態(tài)區(qū))，某多態(tài)區(qū)的堿基序 列窗基酸序列)在多個HLA等位基因（HLAallele)中是共同的情況多。即，各HLA等位基 因通過多個多態(tài)區(qū)的組合來規(guī)定。在HLAI類抗原中，不僅外顯子內(nèi)的多態(tài)區(qū)、而且具有同 一堿基序列的外顯子2或外顯子3有時也在多個等位基因中是共同的。
[0007] 由于HLA中存在高度多態(tài)，已知HLA等位基因的種類極多，它們的表示法也得到確 定。目P，辨別血清學(xué)HLA型的第1區(qū)域（2位數(shù)水平)、辨別同一血清學(xué)HLA型內(nèi)伴有氨基酸 替換的等位基因的第2區(qū)域（4位數(shù)水平)、辨別確認到不伴有氨基酸突變的堿基替換的等 位基因的第3區(qū)域（6位數(shù)水平)、和辨別編碼HLA分子的基因區(qū)域外（內(nèi)含子）中伴有堿基 替換的等位基因的第4區(qū)域（8位數(shù)水平）（圖2)。
[0008] 據(jù)稱在骨髓移植之際，如果希望移植者與供體的HLA型（HLA-A、HLA-B、HLA-C、 HLA-DRB1)在4位數(shù)水平上完全匹配，則移植的成功率提高，重度的移植物抗宿主病（Graft Versus化stDisease;GVHD)頻率降低。相反，如果HLA型在4位數(shù)水平上不一致則 發(fā)生引起排斥反應(yīng)等的不良情況的危險性變高。所W，準確且高精度地實施HLA分型在臨 床上也極其重要。 W09] 作為HLA基因中的DNA分型法，基于聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase化ain Reaction;PCR)的SBT(基于序列分型）法、SS0 (序列特異性寡核巧酸）-Luminex法是主 流。
[0010] 運些W往的DNA分型法具有能夠?qū)Χ鄶?shù)樣品迅速進行分型的優(yōu)勢，但在多態(tài)區(qū)、 I類基因的情況下，也有時不能準確確定外顯子的染色體上的順反位置關(guān)系，產(chǎn)生相位模糊(phase ambiguity),有時難W進行高精度的HLA分型。 W11] 另外，W往的方法是W各HLA基因的外顯子區(qū)域為中屯、的采用了PCR的DNA分型 法，因而會忽略內(nèi)含子區(qū)域、啟動子區(qū)域中的堿基替換，其結(jié)果是，有可能忽略雖然基因結(jié) 構(gòu)與其它的表達HLA基因一樣但表達受抑制的無效（null)等位基因的檢測。 陽01引例如，專利文獻1中記載的方法中，由于各HLA基因的PCR條件并不相同，因而必 須獨立實施各HLA基因的PCR，而與操作的迅速化和簡便化并無關(guān)系。
[0013] 本發(fā)明人等提出了通過使用與HLA的各基因座的上游區(qū)域和下游區(qū)域分別特異 性地退火的引物組而能夠進行沒有相位模糊的高精度的分型的方法(專利文獻2和非專利 文獻2)。然而，在該方法中，各基因所采用的PCR條件未被完全統(tǒng)一，尚未達到同時實施所 有基因座的PCR的多重法。
[0014] 進而，對于在進行PCR的迅速化受到期待的PCR時使溫度的上升或下降所需的時 間大幅縮短的高速PCR裝置并無研究。
[0015] 現(xiàn)有技術(shù)文獻 專利文獻 專利文獻1 :日本特開平11-216000號公報 專利文獻2 :國際公開W02013/011734號小冊子 非專利文獻 非專利文獻 1 :LindC.等、HumanImmunology、第 71 卷、1033-1042 頁（2010 年） 非專利文獻 2 :ShiinaT.等、TissueAntigens、第 80 卷、305-316 頁（2012 年）。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 發(fā)明要解決的技術(shù)問題 本發(fā)明的課題在于：開發(fā)能夠使新設(shè)計了基因特異性引物的包含HLA-DRB3/DRB4/ DRB5的各HLA基因的PCR條件(退火溫度)相同，并基于該條件將各HLA基因在同一容器內(nèi) 同時進行PCR擴增的多重PCR法；進而提供能夠通過設(shè)定將該方法適用于高速PCR裝置時 的多重PCR法的條件(延伸反應(yīng)所需的時間)，而排除來源于相位模糊的不明確，并且實現(xiàn)迅 速化和簡便化的超高分辨率DNA分型方法。
[0017] 用于解決技術(shù)問題的方法 為了解決上述的問題，本發(fā)明人等反復(fù)深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過再設(shè)計用于各HLA基 因的引物并選擇使用的DNA聚合酶，能夠在同一條件下進行PCR而不管HLA基因的種類如 何，從而完成了本發(fā)明。
[0018] 目P，本發(fā)明提供包括W下步驟的HLA的DNA分型方法。
[0019] (1)制備分別特異性地與選自屬于人基因組堿基序列中的HLA I類和II類的基因 中的至少2種基因的上游區(qū)域和下游區(qū)域雜交、并且在相同的PCR條件下進行擴增的引物 組的步驟； (2) 使用所述引物組，在相同的PCR條件下在相同容器內(nèi)同時擴增被檢試樣（DNA)中的 所述至少2種基因的步驟； (3)確定PCR產(chǎn)物的堿基序列的步驟；和 (4) 任選地實施與數(shù)據(jù)庫的同源性檢索的步驟。
[0020] 發(fā)明效果 本發(fā)明是：特別是對于作為HLAI類抗原的HLA-A，HLA-B和HLA-C、HLAII類抗原即HLA-DRB1，HLA-DRB3/4/5、HLA-DQA1、HLA-D地 1、HLA-DPA1 和HLA-DPB1，新設(shè)計能夠特異性 地并且在相同退火溫度下擴增運些HLA基因的PCR引物；選擇適宜于本DNA分型方法的DNA 聚合酶；設(shè)定在使用該酶時能夠W1臺PCR裝置1次進行所有HLA基因的DNA分型的優(yōu)選 PCR條件；開發(fā)基于該條件的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1的多重PCR法；進而設(shè)定使用 高速PCR裝置時的多重PCR法的延伸反應(yīng)所需的時間；運用高通量測序技術(shù)，由此解決了上 述現(xiàn)有技術(shù)的問題的發(fā)明。
[002U 本發(fā)明的方法可得到來自1分子的HLA基因的DM分型所需的全部堿基序列，因 此是確認不到順反位置關(guān)系不清楚的相位模糊的終極DNA分型法，例如，移植時的希望移 植者與供體候補之間的高精度的HLA的一致得W實現(xiàn)。
[0022] 因為HLA基因的包括啟動子區(qū)域、外顯子區(qū)域、內(nèi)含子區(qū)域等周邊區(qū)域的基因全 部堿基序列被確定，因而可W檢測出表達受到抑制的無效等位基因和新等位基因。
[0023] 本發(fā)明中，由于設(shè)定了能夠W1臺PCR裝置1次進行多個至全部HLA基因的DNA 分型的適宜PCR條件，因而操作上的迅速化和簡便化得到實現(xiàn)。
[0024] 本發(fā)明中，由于提供多個HLA基因的多重PCR法，因而希望移植者與供體候補之間 的HLA型的更高精度并且更迅速的HLA分型得到實現(xiàn)。
【附圖說明】
[00對[圖U是示出HLA-DR基因區(qū)域的圖。引用自豬子英俊、籃月健彥、十字猛夫主 編，"移植·輸血検査學(xué)"，講談社虧^工シテ斗フ斗ック，2004年，第48頁。
[0026] [圖2]是示出HLA等位基因的分類法的圖。引用自IMGT-HLA數(shù)據(jù)庫（WWW.ebi. ac.uk/ipd/imgt/hla/)。
[0027][圖3] (a)是示出HLAI類基因結(jié)構(gòu)與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)聯(lián)性的圖。（b)是示出HLA I類基因的啟動子區(qū)域的結(jié)構(gòu)的圖。引用自豬子英俊、籃月健彥、十字猛夫主編，"移植· 輸血検査學(xué)"，講談社虧^工シテック，2004年，第35頁。
[0028] [圖4]是示出各HLA基因的結(jié)構(gòu)的模式圖。
[0029][圖引（a)是示出HLAII類基因結(jié)構(gòu)與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)聯(lián)性的圖。（b)是示出HLA II類基因的啟動子區(qū)域的結(jié)構(gòu)的圖。引用自豬子英俊、籃月健彥、十字猛夫主編，"移植· 輸血検査學(xué)"，講談社虧^工シテ斗フ斗ッ