用于鑒別小麥矮腥黑粉菌和小麥光腥黑粉菌的抗原及多克隆抗體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于鑒別小麥矮腥黑粉菌和小麥光腥黑粉菌的抗原及多克隆抗體，屬 于植物病害防治領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 由小麥光腥黑粉菌（Tilletiafoetida(Wallr. )Liro，TFL)引起的小麥光腥黑粉 病是世界上最具破壞性的小麥病害之一，在我國北方麥區(qū)發(fā)生較多，是北京市補(bǔ)充農(nóng)業(yè)植 物檢疫性有害生物。此病菌孢子含量超過0.6%即可引起嚴(yán)重中毒現(xiàn)象，人畜食后重者可引 起惡心、嘔吐甚至昏迷等中毒癥狀（Goats, 1999 ;Hoffman，1982)，嚴(yán)重影響小麥品質(zhì)及商 業(yè)價(jià)值。
[0003] 小麥矮腥黑穗病是由小麥矮腥黑粉菌（TilletiacontroversaKUhn，TCK)引起的 重要國際檢疫性病害，也是我國對外檢疫的一類危險(xiǎn)性植物病害。該病害危害大、防治難， 一旦傳入會給小麥生產(chǎn)帶來毀滅性危害，通常發(fā)病率約等于小麥產(chǎn)量損失率。
[0004] 小麥光腥黑粉菌和小麥矮腥黑粉菌的田間侵染癥狀以及孢子形態(tài)和顏色十分相 似，在田間觀察時(shí)很難區(qū)分。目前，常用的鑒別方法是PCR反應(yīng)或顯微鏡檢測，但這兩種方 法都需要用到儀器，只能在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，并且PCR反應(yīng)耗時(shí)長，工序復(fù)雜。因此，需要研發(fā) 一種簡便、快速、準(zhǔn)確的方法來鑒別小麥光腥黑粉菌和小麥矮腥黑粉菌，從而采取相應(yīng)的防 治措施，控制病害的進(jìn)一步發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為滿足上述領(lǐng)域的需求，本發(fā)明提供一種抗體，該抗體能夠特異識別小麥矮腥黑 粉菌，從而將小麥矮腥黑粉菌和小麥光腥黑粉菌區(qū)別開來。
[0006] 本發(fā)明請求保護(hù)的技術(shù)方案如下：
[0007] -種用于制備鑒別小麥矮腥黑粉菌和小麥光腥黑粉菌的多克隆抗體的半抗原，其 氨基酸序列如SEQIDN0 :1所示。
[0008] -種用于制備鑒別小麥矮腥黑粉菌的多克隆抗體的免疫原，其特征在于，對權(quán)利 要求1所述的半抗原進(jìn)行改造和偶聯(lián)，步驟如下：
[0009] 取權(quán)利要求1所述的半抗原6mg，用lmLDMF溶解，得到溶液A;取15mgEDC和NHS， 用0. 2mLPH5. 0MES充分溶解后，加入溶液A中，室溫下攪拌24h，即可得到反應(yīng)液B;稱取牛 血清白蛋白BSA50mg，使之充分溶解在3. 8mLPH7. 2的0. 1MPBS中，將反應(yīng)液B逐滴緩 慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24h，在4°C下，用0.Olmol/LPBS透析3天，每天換 3次透析液；分裝，保存于_20°C備用。
[0010] -種用于免疫方法鑒別小麥矮腥黑粉菌的包被抗原，其特征在于，對權(quán)利要求1 所述的半抗原進(jìn)行改造和偶聯(lián)，具體步驟如下：
[0011] 取權(quán)利要求1所述的半抗原4mg，用lmLDMF溶解，得到溶液A;取2. 5 %的戊二 醛200ul，加入A溶液，反應(yīng)30min即可得到反應(yīng)液B;稱取卵清蛋白50mg，使之充分溶解在 3. 8mL0. 1MCB中，將反應(yīng)液B逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌16h，再加入硼 氫化鈉還原反應(yīng)2小時(shí)，然后在4°C下，用0.Olmol/LPBS透析3天，每天換3次透析液；分 裝，保存于-20 °C備用。
[0012] 用于鑒別小麥矮腥黑粉菌和小麥光腥黑的多克隆抗體，其采用以下步驟制備而 得：
[0013] (1)以權(quán)利要求2所述的免疫原免疫家兔，篩選產(chǎn)生高效價(jià)全血的家兔；
[0014] (2)對選中的家兔采取全血，分離純化獲得多克隆抗體；
[0015] 所述免疫包括多次，初次免疫0. 2mg/次/只，第二次開始0.lmg/次/只。
[0016] 篩選產(chǎn)生高效價(jià)全血的家兔指采集被免疫的家兔的血清，進(jìn)行競爭抑制檢測試 驗(yàn)。
[0017] 用于鑒別小麥矮腥黑粉菌和小麥光腥黑粉菌的方法，其特征在于，包括如下步 驟：
[0018]a、包板：將待測樣品的孢子用抗原稀釋液稀釋200倍，混勻并加入酶標(biāo)板，每孔各 100ul，37°C孵育2小時(shí)，洗板一次，拍干；
[0019] b、封閉：每孔加入150ul封閉液進(jìn)行封閉，37°C孵育2小時(shí)，棄液，拍干，備用；
[0020] c、加抗體：用抗體稀釋液將權(quán)利要求4所述的多克隆抗體稀釋9000倍，每孔各加 入50ul，37°C孵育30分鐘；
[0021] d、洗滌：洗板3_5次，每次間隔30秒，拍干；
[0022] e、加酶標(biāo)二抗：加入稀釋1000倍的HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體，每孔100ul，37°C孵育 30分鐘；
[0023] f、洗滌；洗板3-5次，每次間隔30秒，拍干；
[0024] g、顯色：加入等量A/B底物顯色液，每孔100ul，37°C孵育15分鐘；
[0025] h、終止：加入終止液終止反應(yīng)；
[0026]i、讀數(shù)：所使用酶標(biāo)儀的波長為450nm/630nm，讀取0D值；
[0027] 若0D值大小為1. 8~2. 0,則待測樣品為小麥矮腥黑粉菌。
[0028] 本發(fā)明提供的抗原蛋白，其氨基酸序列來自小麥矮腥黑粉菌和小麥光腥黑粉菌的 共有蛋白序列。采用所述抗原蛋白免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，獲得的抗體能夠特異識別小麥矮腥黑粉 菌，而不能與小麥光腥黑粉菌產(chǎn)生抗原抗體反應(yīng)，因此能夠用于鑒別田間難以區(qū)分的小麥 矮腥黑穗病和小麥光腥黑穗病。所述抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體。
[0029] 本發(fā)明用于鑒別小麥矮腥黑粉菌和小麥光腥黑粉菌的方法，操作十分簡便，能夠 快速、準(zhǔn)確地判斷待測樣品是小麥矮腥黑粉菌。只需取疑似小麥矮腥黑粉菌的孢子與本發(fā) 明抗體在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件下進(jìn)行反應(yīng)，如果出現(xiàn)抗原抗體反應(yīng)，則該樣品是小麥矮腥黑粉 菌，如果不能發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，則該樣品是小麥光腥黑粉菌。整個(gè)過程無需儀器，技術(shù)人 員可以攜帶相關(guān)試劑和耗材，在野外就能完成兩種黑粉菌的鑒別。
【附圖說明】
[0030] 圖1.多克隆抗體的制備流程圖，
[0031] 免疫時(shí)間安排：如表1所示，初次免疫15天后進(jìn)行第二次免疫，15天后進(jìn)行第三 次免疫，7天后第一次采血檢測，7天后進(jìn)行第四次免疫，7天后第二次采血檢測，7天后進(jìn)行 第五次免疫，7天后第三次采血檢測，以此類推，每組均完成至少6次免疫與4次采血檢測。 其中，E004組的實(shí)驗(yàn)兔子免疫效果較好，為本次實(shí)驗(yàn)的優(yōu)選組，其免疫時(shí)間安排如表2所 不。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，需要理解的是，下述實(shí)施例僅 作為解釋和說明，而不以任何形式限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0033] 小麥矮腥黑粉菌（TilletiacontroversaKUhn):本發(fā)明所有的小麥矮腥黑 粉菌菌株為現(xiàn)有文獻(xiàn)L.GAOetal.DevelopmentofaSCARMakerbyinter-simple sequencerepeatfordignoisisofDwarfBuntofWheatandDetectionof TilletiacontroversaKUhn.FoliaMicrobiol. 55(3)，258 - 264(2010)所記載，參 見其中材料與方法部分記載的在美國由B.Goates教授分離到的分離株。另外也記 載在L.GAOetal.AnISSR-basedApproachfortheMolecularDetectionand DiagnosisofDwarfBuntofWheat,CausedbyTilletiacontroversaKu"hn.J 卩1171：(^31:11〇1159:155 - 158(2011)，為其中材料與方法部分記載的〇11313；^6〇3七68所提供 的TCK菌株。
[0034] 小麥光腥黑粉菌：本發(fā)明所使用的小麥光腥黑粉菌為現(xiàn)有文獻(xiàn)《小麥光腥黑穗菌 萌發(fā)的超微結(jié)構(gòu)研究》，西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999,03期（3) : 110-112所記載的菌株。
[0035] 上述生物材料本實(shí)驗(yàn)室亦有保存，可自申請日起二十年內(nèi)向公眾發(fā)放用于驗(yàn)證實(shí) 驗(yàn)。
[0036] 以下實(shí)施例中未特別說明的生物化學(xué)試劑均為本領(lǐng)域常規(guī)試劑，可以通過本領(lǐng)域 常規(guī)方法配制而得或商購獲得，規(guī)格為實(shí)驗(yàn)室純級即可。
[0037] 實(shí)施例1.用于鑒別TCK和TFL的多克隆抗體制備
[0038] 試劑與溶液：
[0039] 弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑（北京勤邦生物技術(shù)有限公司），磷酸鹽緩沖液 (PBS，0. 02M，ρΗ7· 2)，包被液（磷酸鹽緩沖液，0· 05M，ρΗ7· 4)，反應(yīng)稀釋液（PBS1，0. 03M，pH7. 4+0. 05%吐溫20)，洗滌工作液（用去離子水將20X濃縮洗滌液按1 :19體積比進(jìn)行 稀釋）；封閉液（在〇· 〇2mol/LPBS1中加入0· 05%BSA)，底物顯色液：由A液和B液組成， A液為過氧化氫，B液為四甲基聯(lián)苯胺；終止液（2mol/LH2S04)，酶標(biāo)二抗（北京勤邦生物技 術(shù)有限公司）。
[0040] 小麥矮腥黑粉菌懸液1*105孢子/ml
[0041] 主要儀器設(shè)備：
[0042] 真空冷凍干燥機(jī)，電熱恒溫培養(yǎng)箱，ProteinA/G柱，電泳槽、電泳儀，酶標(biāo)板，酶標(biāo) 儀，低溫高速離心機(jī)，ProteinA層析柱等。
[0043] 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：新西蘭大耳兔，購自中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院。
[0044] 1、多肽合成
[0045]利用ITRAQ分析小麥矮腥黑粉菌（TCK)和小麥光腥黑粉菌（TFL)的蛋白質(zhì)，得到TCK和TFL的共有蛋白序列（SEQIDNO:2)，其氨基酸序列為：
[0046]APGHRDFIKNMITGTSQADCAILIIAGGTGEFEAGISKDGQTREHALLAFTLGVRQLIVAVNKMDTTKY SEERFHEIVKETSNFIKKVGFNPKSVAFVPISGWHGDNMIEPTANMPWYKGWEKETKAGKSSGKTLLDAIDAIEPPS RPTDKPLRLPLQDVYKIGGIGTVPVGRVETGIIKAGMVVTFAPSNVTTEVKSVEMHHEQLVEGNP⑶NVGFNVKNVS VKDIRRGNVCSDSKNDPAMEAASFIAQVIVMNHPGQIGAGYAPVLDCHTAHIACKFAELVEKIDRRSGKSIEDAPKF IKSGDAAMVKMIPTKPMCVEAFNVYPPLGRFAVRDM
[0047] 根據(jù)上述共有蛋白序列設(shè)計(jì)獲得多條多肽，篩選獲得能夠區(qū)分小麥矮腥黑粉菌和 小麥光腥黑粉菌的抗原蛋白（SEQIDN0:1)，其多肽序列為：EPPSRPTDKPLRLC。由北京勤邦 生物技術(shù)有限公司對上述抗原蛋白進(jìn)行化學(xué)合成，獲得半抗原。
[0048] 2、多抗制備
[0049] 半抗原偶聯(lián)：取步驟1合成的的半抗原6mg，用lmLDMF溶解，得到溶液A;取 15mgEDC和NHS，用0. 2mLPH5. 0MES充分溶解后，加入溶液A中，室溫下攪拌24h，即可得到 反應(yīng)液B;稱取牛血清白蛋白BSA50mg，使之充分溶解在3. 8